Экспрессия это в биологии: What is Gene Expression?

Содержание

What is Gene Expression? | Protocol (Translated to Russian)

14.1: Что такое экспрессия гена?

Обзор

Экспрессия генов – это процесс, в котором ДНК направляет синтез функциональных продуктов, таких как белки. Клетки могут регулировать экспрессию генов на различных стадиях. Это позволяет организмам генерировать различные типы клеток и позволяет клеткам адаптироваться к внутренним и внешним факторам.

Генетическая информация переходит от ДНК к РНК к белку

Ген является участком ДНК, который служит в качестве плана для функциональных РНК и белков. Поскольку ДНК состоит из нуклеотидов, а белки состоят из аминокислот, необходим посредник для преобразования информации, кодируемой в ДНК, в белки. Этот посредник является мессенджером РНК (мРНК). мРНК копирует план из ДНК процессом, называемым транскрипцией. В эукариотах транскрипция происходит в ядре путем дополнительного базового сопряжения с шаблоном ДНК. Затем мРНК обрабатывается и транспортируется в цитоплазму, где она служит шаблоном для синтеза белка во время трансляции. У прокариот, в которых нет ядра, процессы транскрипции и трансляции происходят в одном и том же месте и почти одновременно, так как новообразованная мРНК подвержена быстрой деградации.

Экспрессия генов может регулироваться на любом этапе во время транскрипции

Каждая клетка организма содержит одинаковую ДНК, и, следовательно, один и тот же набор генов. Тем не менее, не все гены в клетке «включены» или используются для синтеза белков. Ген, как говорят, «выражается», когда белок, который он кодирует, вырабатывается клеткой. Экспрессия генов регулируется для обеспечения правильного генерации белков в определенных клетках в определенное время. Различные внутренние и внешние механизмы регулируют экспрессию генов до и во время транскрипции.

Структура хроматина- уплотненной ДНК и связанных с ней белков гистона — может быть химически изменена, чтобы быть открытой или закрытой. Такие изменения позволяют или ограничивают доступ транскрипционной машины к ДНК. Модификация хроматина является внутренним механизмом, используемым во время разработки для формирования различных типов клеток (например, нейрона против мышечной клетки) из одного и того же генома.

ДНК-связывающие белки, называемые транскрипционными факторами, регулируют транскрипцию, связываясь с определенными последовательностями ДНК вблизи или внутри кодирующих областей генов. Транскрипционные факторы, способствующие инициированию транскрипции, называются активаторами. Белки, которые предотвращают связывание механизма транскрипции с местом инициации транскрипции, называются репрессорами. Транскрипционные активаторы или репрессоры реагируют на внешние раздражители, такие как сигнальные молекулы, дефицит питательных средств, температура и кислород.

Экспрессия генов может пост-транскрипционно и пост-трансляционно регулироваться

Экспрессия генов может регулироваться посттранскрипционной обработкой мРНК. В эукариотах транскрибированная мРНК подвергается сплайсированию и другим модификациям, которые защищают концы нити РНК от деградации. Сплайсирование удаляет интроны–сегменты, которые не кодируют белки, и соединяет регионы, кодирующие белок, называемые экзонами. Альтернативное сращивание позволяет выражать функционально разнообразные белки из одного и того же гена. Регулирование экспрессии генов путем альтернативного сращивания играет важную роль в развитии органов, выживании и распространении клеток, а также адаптации к факторам окружающей среды.

Экспрессия генов также может быть изменена путем регулирования трансляции мРНК в белки. Трансляция может регулироваться микроРНК- малыми, некодирующих РНК, которые связываются с определенной последовательностью мРНК и блокируют инициирование трансляции или ухудшают транскрибированную мРНК. Кроме того, белки, называемые трансляционными репрессорами, могут связываться с РНК и мешать инициированию трансляции.

Переведенные полипептиды проходят обработку для формирования функциональных белков. Добавление или удаление химических групп может изменить активность, стабильность и локализацию белков в клетке. Например, добавление или удаление фосфориловых групп (-PO₃²⁾может активировать или инактивировать белки. Аналогичным образом, добавление убиквитиных групп вызывает деградацию белка. Таким образом, пост-трансляционные модификации белка являются заключительной стадией регуляции генов.

Литература для дополнительного чтения

Phillips, Theresa. “Regulation of transcription and gene expression in eukaryotes.” Nature Education 1 no. 1 (2008): 199 [Source]

Ralston, Amy. “Examining histone modifications with chromatin immunoprecipitation and quantitative PCR.” Nature Education 1 no. 1 (2008): 118 [Source]

Экспрессия генов — это… Что такое Экспрессия генов?

У этого термина существуют и другие значения, см. Экспрессия.

Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков.

Регуляция экспрессии генов позволяет клеткам контролировать собственную структуру и функцию и является основой дифференцировки клеток, морфогенеза и адаптации. Экспрессия генов является субстратом для эволюционных изменений, так как контроль за временем, местом и количественными характеристиками экспрессии одного гена может иметь влияние на функции других генов в целом организме.

Транскрипция и трансляция

У прокариот и эукариот гены представляют собой последовательности нуклеотидов ДНК. На матрице ДНК происходит транскрипция — синтез комплементарной РНК. Далее на матрице мРНК происходит трансляция — синтезируются белки. Существуют гены, кодирующие нематричную РНК (например, рРНК, тРНК, малые РНК), которые экспрессируются (транскрибируются), но не транслируются в белки.

Регуляция

Компактизация ДНК

Привлечение факторов транскрипции

Регуляция после транскрипции

МикроРНК — это короткие (18—25 нуклеотидов) последовательности односпиральной РНК, вызывают подавление экспрессии генов. МикроРНК связываются со своей мишенью — информационной РНК — по принципу комплементарности . Это вызывает подавление синтеза белка или деградацию информационной РНК.

МикроРНК могут иметь большую или меньшую специфичность благодаря большей или меньшей доле комплементарных своей мишени азотистых оснований. Низкая специфичность позволяет одной микроРНК подавлять экспрессию сотен разных генов.^[1]

Моноаллельная экспрессия генов

Моноаллельная экспрессия у эукариот характерна:

для генов Х-хромосомы в женских клетках из-за механизма дозовой компенсации;
для импринтируемых генов;
В настоящее время известно, что около 5—10 % генов эукариот экспрессируются в клетках моноаллельно, среди таких генов чаще наблюдаются гены, кодирующие поверхностные клеточные белки и, в частности, гены, кодирующие иммуноглобулины, Т-клеточные и обонятельные рецепторы. Это явление носит также название аллельное исключение. Выбор экспрессирующегося аллеля происходит рано в развитии, и этот выбор осуществляется случайно, в результате около половины клеток организма экспрессируют отцовский аллель, а другая половина клеток — материнский аллель. Иногда наблюдается тканеспецифичная моноаллельная экспрессия гена, в других тканях такой ген может экспрессироваться биаллельно. К случайной моноаллельной экспрессии аутосомных генов не относят случаи, когда разные алллели гена экспрессируются на различном уровне из-за полиморфизма в cis-регуляторных последовательностях гена^[2].

См. также

Репрессия генов

Примечания

Литература

Патрушев Л. И. Экспрессия генов. — М.: Наука, 2000. — ISBN 5-02-001890-2

Экспрессия — что это и как она проявляется?

Вам приходилось слышать выражения «экспрессивная девушка» или «экспрессивный танец»? Слово «экспрессия» в переводе означает выразительность, интенсивное проявление настроения и эмоций. Экспрессия еще толкуется в качестве предъявления другим людям скрытых психологических личностных особенностей для прямого наблюдения.

Определение экспрессии

Что такое экспрессия? В медицине это генетический процесс, посредством которого содержащаяся в генах информация преобразуется в определенные клеточные структуры. Экспрессивность в биологии – это неразрывно связанное с жизнедеятельностью и здоровьем человека определение, которое получает дальнейшее развитие в психологии и психотерапии. К этой же медицинско-биологической сфере относится понятие «экспрессировать» – это означает транскрибировать и транслировать ген.

Экспрессивность – это степень выраженности определенного состояния, чувства, эмоции, отношения. Понятия «экспрессивность» и «экспрессия» применяются не только в психологии, но и в театроведении, искусствоведении, если требуется подчеркивать уровень выраженности духовности. А также показать средства выражения, к примеру, живопись, музыка, архитектурные элементы. Получается, что в имеющихся определениях данных терминов есть указания на связь этого явления с душевным и духовным миром людей.

Экспрессия – это выразительность чувств и эмоций, показ внутреннего состояния путем проявления его во внешности.

Противоположным по смыслу значением является импрессивность – склонность к внутренним, а не внешним переживаниям, накоплению преимущественно отрицательных чувств. О таких людях говорят, что они держат переживания в себе, не склонны делиться эмоциями и проблемами, обиды и расстройства к ним приходят не сразу, не моментально.

Мнения о связи внутреннего мира людей и экспрессии, которые сформировались по большей части в искусствоведении и философии, дополняются психологией. Сущность этой связи в психологическом выражении видна в том, что экспрессия получает место не только сопровождения действий внешне. Она выступает частью данных явлений, формой их проявления.

Экспрессивная девушка рассказывает что-то своей подруге

По этой причине стоит говорить об экспрессии в виде личностного образования, способа познания духовного мира личности, а также в качестве внешнего «Я».

Экспрессивное поведение

В науке под личностным экспрессивным поведением подразумевается соединение стойких и изменяющихся средств выражения, что организуются в разного рода структуры. Они перестраиваются в процессе создания социальных и психологических личностных качеств.

Подобное соединение средств включает части, которые обладают разным развитием изменений, а также отличаются уровнем требуемых усилий для этой цели. Итак, в составе личностного экспрессивного поведения содержатся части, которые обладают высоким уровнем непостоянства (мимика, интонации), в том числе средним и низким уровнями. Если человек экспрессивен, это включает и физиогномические элементы выразительности, одежда и прическа относятся к среднему уровню непостоянства. Существует также понятие «экспрессивный репертуар человека», означающий набор поз, интонаций, жестов, мимических состояний и их комбинаций для различных ситуаций общения.

Что такое экспрессивный человек? Это значит, что поведение личности представляет собой постоянно изменяющееся самоизваяние. Наше тело является зеркалом, которое отражает действие внешности и души. Внутренние перемены личности тянут за собой внешние изменения. По этой причине внешний вид не является беспорядочным сочетанием элементов, а строгим четким отражением личностных особенностей.

В экспериментальной науке привилегию получают непостоянные элементы экспрессии. Это сочетание движений, которые неустанно меняются согласно с положением и отношением человека. Подобные движения показываются с применением оптической системы. К зрительным методам общения психологами относится кинесика. Она являет собой широту движений, которая воспринимается зрительно и несет разную информацию с разных точек зрения партнеров. В ее состав включены только показательные жесты и позы с четкой семантикой.

Экспрессивных людей отличает эмоциональное, выразительное поведение

Экспрессивные действия в виде внешнего «Я» связаны с его непостоянными и стойкими подструктурами. Это действительный показатель множества черт личности. Его можно рассматривать в виде:

проявления выразительных элементов всеобщей личностной активности, которая связана с темпераментом;
выразительного состава состояний психики;
показателя модальности знаков связи одной личности с другой;
способы экспрессии качеств;
признака развитости личности как субъекта коммуникации;
показа выразительных элементов социального статуса человека;
скрытия внешних «Я» личности;
способа показа и создания допустимого поведения.

Экспрессивность личности

Экспрессивность личности – это умение ярко и живо показывать собственные чувства, эмоции и отношение. Это понятие противоположно сдержанности. По мнению А. Маслоу, в нормальной личности обе черты существуют в гармонии, балансе. Адекватная личность не просто спонтанна: она спонтанна и экспрессивна тогда, когда ей этого хочется. Она способна расслабляться, отказываться от контроля, когда это к месту. Но такая личность способна и контролировать себя, откладывать удовольствия, проявлять вежливость и т. д.

В сопутствующих экспрессивности качествах нет обдуманности, осторожности, разумности и самообладания. Ее спутниками является возбудимость, внезапность и восторженность.

Наша душа отличается природной красотой. В зависимости от качеств личности, которые обуславливают демонстрацию энергетики души, наружу выходят инстинктивность, темпераментность, восторженность. А если энергетика души обуславливается пороками, то во внешнем мире проявляется необузданность и излишняя эмоциональность.

Экспрессивная личность проявляет все эмоции и чувства ярко, несдержанно. Для нее характерна чрезмерная возбудимость.

Слово «экспрессия» пришло из латыни – expressio, что означает нагнетание и выжимание. Экспрессия является внешним выражением переживаний и эмоций в первую очередь. Сюда стоит отнести слезы, истерику, восклицания, эмоциональные жесты, печаль, крики, апатичное состояние. В лингвистике русского языка присутствует термин «экспрессема» – это стилистическая единица, которая служит для раскрытия выразительных конструкций.

В каждой культуре экспрессивность в виде личностной черты по-разному трактуется. Активно жестикулирующий испанец в странах Прибалтики будет считаться экспрессивным человеком. Но на Родине его примут за меланхоличного человека. Получается, что проявление экспрессии немало определяется особенностью культуры.

Экспрессивная личность проявляет все эмоции и чувства ярко, несдержанно

В психологии эмоциональная экспрессия – это выразительность, сила проявления чувств, переживаний. Она рассматривается в виде обширного набора средств, применяя который личность показывает свои способности другим. Экспрессию в виде показа эмоций сумели «поймать» художники-экспрессионисты. Если зрители способны видеть в работах выражение эмоций, то они считаются экспрессивными.

Заключение

Понятно, что нет такого прибора или датчика, чтобы измерить, сколько экспрессии содержится в картине художника, хореографическом танце или поведении человека. Экспрессивные действия являются зеркалом, которое отражает или показывает состояние личности. Более того, подобное поведение – это часть естественного состояния человека.

И на десерт предлагаем видео – по-настоящему экспрессивное выступление гимнасток на Кубке России по эстетической гимнастике:

Составлена самая подробная карта экспрессии генов в эмбрионе дрозофилы

Секвенирование РНК из тысяч индивидуальных клеток позволило германским биологам составить самую детальную на сегодняшний день карту экспрессии генов в эмбрионе дрозофилы на стадии начала гаструляции. Карта довольно точно отражает экспрессию 6–8 тысяч генов в каждой клетке эмбриона. Она позволяет решать разнообразные исследовательские задачи: обнаруживать неизвестные ранее регуляторы развития, анализировать общие закономерности трехмерной организации эмбриона и эволюции онтогенеза. Работа представляет собой важный шаг на пути к решению главной задачи биологии развития — полному и исчерпывающему пониманию того, как генотип воплощается в фенотипе.

Ключевую роль в эмбриональном развитии играет дифференцировка клеток, в основе которой лежит включение разных наборов генов в разных клетках в ответ на определенные сигналы (см. Как клетки понимают, что одни должны стать волосами, другие костями, третьи мозгами и т. п.?). Паттерны экспрессии генов — регуляторов развития создают пространственную разметку эмбриона, поэтапно рисуя на нем нечто вроде чертежа будущего организма (рис. 1).

Для дрозофилы Drosophila melanogaster, одного из самых изученных животных, уже известны пространственно-временные паттерны экспрессии десятков регуляторных генов. Это позволило в общих чертах разобраться в том, как формируются передний и задний концы тела, спинная и брюшная стороны, сегменты и органы (см. Михаил Никитин. Генные сети, управляющие строением тела животных). Но всё же картина остается неполной: изучены далеко не все гены, влияющие на развитие, а области их экспрессии картированы зачастую лишь приблизительно.

В идеале хотелось бы иметь точную информацию по экспрессии каждого гена в каждой клетке эмбриона на каждом этапе развития. Но возможно ли это? До сих пор такой уровень детализации был недостижим. Но наука не стоит на месте, и то, что казалось еще недавно недостижимой мечтой, вдруг становится реальностью.

В статье, опубликованной в журнале Science 13 октября, ученые из Центра Молекулярной Медицины Макса Дельбрюка (Max Delbrück Center for Molecular Medicine) в Берлине сообщили о создании самой детальной на сегодняшний день карты генной экспрессии эмбриона дрозофилы на этапе развития, предшествующем началу морфогенеза. В это время (так называемая стадия 6, см. Stage 6) эмбрион состоит примерно из 6000 клеток, еще не имеет видимых морфологических структур и только приступает к гаструляции.

Авторы сделали всё возможное, чтобы включить в анализ максимальное число генов (причем не только белок-кодирующих, но и генов регуляторных РНК), и чтобы добиться максимального пространственного разрешения, картировав экспрессию в каждой клетке эмбриона по отдельности. Для этого они воспользовались недавно изобретенной технологией Drop-Seq, основанной на помещении клеток в крошечные капельки воды, мечении РНК в каждой капле особой меткой и последующем тотальном секвенировании РНК (см. E. Z. Macosko et al., 2015. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets). Метод Drop-Seq позволяет одновременно измерить в каждой клетке экспрессию нескольких тысяч генов. Индивидуальные метки дают возможность понять, какие из отсеквенированных молекул РНК происходят из одной и той же, а какие — из разных клеток.

Авторам удалось с высокой точностью измерить экспрессию генов примерно в 1300 клетках эмбрионов дрозофилы на стадии 6. Для каждой клетки уровень экспрессии был надежно определен в среднем для 3100 генов.

Предварительный анализ полученных данных показал, что профили экспрессии в разных клетках эмбриона различаются очень сильно: свой уникальный профиль имеет чуть ли не каждая клетка. Это значит, что составление карты экспрессии с максимальным, то есть клеточным уровнем разрешения — не блажь, а правильный и необходимый шаг на пути к пониманию механизмов развития.

К сожалению, метод Drop-Seq требует предварительного разделения эмбриона на отдельные клетки. При этом информация о том, из какой части эмбриона происходит та или иная клетка, теряется, и ее нужно потом как-то восстановить. В этом и состояла главная методологическая трудность, которую авторы должны были преодолеть. Для этого они использовали ту информацию по паттернам экспрессии отдельных генов, которая была получена ранее. В частности, в рамках проекта Berkeley Drosophila Transcription Network Project (BDTNP) была с большой точностью картирована экспрессия 84 генов — регуляторов развития (C. C. Fowlkes et al., 2008. A Quantitative Spatiotemporal Atlas of Gene Expression in the Drosophila Blastoderm). Проанализировав эти данные и сопоставив их с результатами Drop-Seq, авторы пришли к выводу, что, зная уровень экспрессии каждого из 84 генов в анализируемой клетке, можно довольно точно (с точностью до нескольких клеточных диаметров) определить, из какого места эмбриона происходит клетка.

Таким образом, каждая клетка была надежно «привязана» к определенному, очень небольшому участку эмбриона. Поскольку к каждому такому участку была привязана не одна, а несколько клеток, в каждой из которых был измерен уровень экспрессии в среднем 3100 генов (причем наборы генов с измеренной экспрессией были разными для разных клеток), то для каждого участка удалось в конечном счете оценить экспрессию 6–8 тысяч генов.

В результате получилась самая детальная на сегодняшний день трехмерная карта экспрессии генов в эмбрионе дрозофилы на стадии начала гаструляции. Карта представлена в виде интерактивной системы Drosophila Virtual Expression eXplorer (DVEX), которая для любого выбранного гена может показать паттерн экспрессии.

Авторы сравнивали изображения, нарисованные их программой, с реальными паттернами экспрессии отдельных генов, полученными классическим способом — при помощи гибридизации in situ. Сравнение показало, что карта получилась довольно точная (рис. 2).

Значение этой работы в том, что специалисты по биологии развития получили новый мощный инструмент для решения разнообразных научных задач. В заключительной части статьи авторы показали несколько возможных направлений, где их детище может найти применение.

Например, можно искать общие закономерности в разнообразии рисунков экспрессии различных генов. Это прольет свет на базовые принципы пространственной организации эмбриона. Авторы попытались классифицировать паттерны экспрессии изученных генов, построив для них дендрограмму сходства (рис. 3). Оказалось, что разнообразие рисунков экспрессии распадается на 10 кластеров, для каждого из которых можно составить обобщенный «архетипический» рисунок экспрессии. Подобные сведения важны для расшифровки регуляторных генных сетей: например, логично предположить, что гены, относящиеся к одному кластеру, имеют сходную систему регуляции, то есть похожим образом реагируют на те или иные сигналы.

Кроме того, подробная карта генной экспрессии может быть использована для обнаружения новых регуляторов развития. Один из примеров показан на рис. 2 справа внизу. Длинная некодирующая РНК CR43432, экспрессия которой ранее не картировалась и чья функция неизвестна, экспрессируется, как выяснилось, там и только там, где не экспрессируются важнейшие гены, контролирующие развитие нейроэктодермы, такие как SoxN. Это значит, что CR43432 с большой вероятностью является регулятором эмбрионального развития: возможно, она ограничивает распространение нейроэктодермы или влияет на развитие клеток, избравших не-нейроэктодермальную судьбу.

Имея точную карту экспрессии, можно проследить, в каких участках эмбриона производятся те или иные сигнальные вещества, и догадаться, для каких участков предназначены эти сигналы. Кроме того, карта поможет в изучении эволюции онтогенеза. Авторы проиллюстрировали эту возможность, построив для другого вида дрозофил, D. virilis, менее детальную карту экспрессии генов на той же стадии развития и обнаружив несколько контрастных отличий от D. melanogaster.

Работа представляет собой важный шаг на пути к решению главной задачи биологии развития, которая состоит в том, чтобы понять, каким образом наследственная информация воплощается в фенотипе. Причем понять не в общих чертах (для дрозофилы это уже, можно сказать, сделано), а во всех подробностях. Обладание полной информацией о том, как регулируется и на что влияет работа каждого гена в ходе онтогенеза, откроет перед человечеством небывалые возможности, вплоть до проектирования искусственных организмов с любыми желаемыми свойствами.

Источник: Nikos Karaiskos, Philipp Wahle, Jonathan Alles, Anastasiya Boltengagen, Salah Ayoub, Claudia Kipar, Christine Kocks, Nikolaus Rajewsky and Robert P. Zinzen. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution // Science. 2017. V. 358. P. 194–199. DOI: 10.1126/science.aan3235.

См. также:
1) Михаил Никитин. Генные сети, управляющие строением тела животных.
2) Шон Кэрролл. Бесконечное число самых прекрасных форм.
3) Как клетки понимают, что одни должны стать волосами, другие костями, третьи мозгами и т. п.?

Александр Марков

Краткий словарь генетических терминов

Краткий словарь основных понятий и терминов, использующихся в генетике

Для понимания того, с чем работает наша компания и зачем эта работа нужна, какие результаты мы получаем и что они вам расскажут, можно прийти на консультацию к специалистам ЦГРМ «ГЕНЕТИКО». А для того, чтобы Вы не забыли, о чем был разговор, и не утонули в море новой информации, мы составили для Вас небольшой словарик основных понятий и терминов, использующихся в генетике.

Основным положением биологической науки является то, что клетка – это самое маленькое из возможных проявление жизни и что новая клетка может появиться только от уже существующей и никак не может возникнуть сама по себе. Конечно, это приводит к большому количеству вопросов о том, как зародилась жизнь и каким образом могла сформироваться самая первая клетка. Но для удобства будем считать обозначенные положения верными в современной реальности планеты Земля, где мы живем. Несмотря на невообразимо огромное разнообразие живых существ, все они состоят из клеток. И у всех клеток есть схожие черты, которые обусловлены самыми простыми жизненными необходимостями. Во-первых, клетка должна как-то отделяться от внешнего пространства – для этого есть специальная оболочка.

Во-вторых, клетка должна питаться – для этого есть разные системы, способные преобразовать энергию света или химических связей в необходимые для жизни вещества и удобную для использования энергию. И еще клетка умеет размножаться. Для выполнения всех этих функций необходимы механизмы, основу которых составляют белки и РНК. А вот инструкция, как эти молекулы должны выглядеть и работать, хранится в специальном отсеке клетки – ядре – в виде ДНК. Ошибки в этой инструкции, которая разрабатывалась миллионы лет, приводят к смерти клетки. А в многоклеточном организме, таком, как у человека, например, клетки взаимодействуют друг с другом, поэтому нарушение в работе одной или нескольких клеток может привести не к смерти всего организма, а к нарушениям его работы – заболеваниям. Также необходимо помнить, что человеческий организм огромная система, ансамбль миллионов разнообразных маленьких организмов, которые выросли из одной единственной клетки – зиготы – результата слияния яйцеклетки и сперматозоида.

ДНК – ДезоксиРибонуклиновая Кислота – полимер, то есть молекула с большим количеством последовательно повторяющихся структурных элементов, который несет всю информацию о генах и белках, необходимых для жизни всего организма. ДНК является картотекой, библиотекой и матрицей, с которой считывается информация в определенной последовательности и определенных условиях, разъяснения о которых записаны как в самой ДНК, так и с помощью различных дополнительных модификаций этой молекулы. Каждой хромосоме соответствует 1 молекула ДНК. Структурными блоками этого полимера являются дезоксирибонуклеотиды (=нуклеотиды), которые бывают 4х видов (А, Т, Г, Ц).

Последовательность ДНК – это то, в каком порядке в молекуле ДНК идут ее структурные элементы – нуклеотиды. Таким образом, генетической информацией является именно последовательность ДНК, а молекула ДНК является ее физическим носителем.

Хромосома – это молекула ДНК, специальным образом обернутая различными белками, которые помогают управляться с такой длинной молекулой, чтобы она не порвалась, не перепуталась с другими ДНК-молекулами и была физически доступна для белков, осуществляющих работу всего генетического аппарата.

РНК –РибоНуклиновая Кислота – полимер, который выполняет функциональную роль переносчика информации, то есть копии, которая делается с ДНК и используется для создания функциональных молекул: специальных РНК или белков. Специальные молекулы РНК могут не являться матрицами, на базе которых синтезируется белок, а сами выполняют структурные, ферментативные или транспортные функции. Главное, что последовательность структурных блоков в молекуле РНК всегда определена последовательностью ДНК соответствующего участка.

Белок – основная функциональная единица живой клетки с самым широчайшим спектром функций и возможностей. Как ДНК и РНК, является полимером, однако имеет химически иные структурные блоки – аминокислоты. Их последовательность, с одной стороны, напрямую зависит от соответствующей последовательности ДНК и может изменяться только в ограниченных и предусмотренных в ДНК инструкций, с другой стороны является основой структуры, в том числе пространственной, возможностей и функции белков разных типов.

Ген – определение гена включает два аспекта: теоретический и физический. Теоретически, то есть умозрительно, геном называют последовательность ДНК (слово, записанное на языке генетики), обладающее определенными свойствами. Как и слово в языке, ген является основой наследственной информации, в то время как различные другие структуры можно отнести к знакам препинания или вспомогательным элементам. Ген является подробной инструкцией для синтеза белка или специфической РНК, которую он кодирует. Причем эта инструкция описывает не только последовательность молекул, но и то в каких условиях и как они должны работать и выполнять свои функции. С физической, то есть материальной, точки зрения, ген – это часть молекулы ДНК с определенными структурными элементами. Как внутри слова есть приставка, корень, суффикс и окончание, позволяющие слову адаптироваться для каждой конкретной фразы, так и у гена есть промотор, экзоны и интроны. Первый обозначает начало гена, экзоны – это ключевая информация о последовательности РНК или белка, а интроны необходимы для регуляции и тонкой настройки работы гена в условиях разных тканей, органов и изменяющейся окружающей среды.

Экспрессия гена – это эффективность работы гена, так как для его функционирования недостаточно его наличия в геноме – с него должна считываться информация. Именно то, как часто и в каком объеме считывается информация с гена, выражают термином экспрессия.

Локус – участок молекулы ДНК, содержащий различный структурные элементы, в том числе один или несколько генов.

Геном– это последовательность всех молекул ДНК организма. Важно помнить, что в каждой клетке одного организма в норме содержатся одинаковые по количеству и последовательностям молекулы ДНК, а различается экспрессия конкретных генов.

Экзом – это последовательности ДНК экзомных участков генов, то есть так называемая основная кодирующая составляющая. Это то, с чем работает организм, в то время как остальная часть генома объясняет, как работать и в каких условиях как применять и настраивать кодирующую часть генома.

Мутация – изменение последовательности ДНК по сравнению другими клетками организма или другими представителями вида. Мутации могут возникать как из-за воздействия внешних неблагоприятных условий, так и из-за того, что наши ферменты работают пусть с редкими, но ошибками. Так как происходит физическое изменение в носителе информации – ДНК, такое изменение может передаваться из поколения в поколение.

Частота мутаций — относительное значение, показывающее у какой доли людей в геноме есть конкретная мутация. Частоту мутации можно рассчитать, как среднюю для всех людей, так и отдельно по расовым или национальным, или любы другим группам. В медицинской генетике под мутацией подразумевают изменение ДНК, которое может быть связано с каким-то заболеванием, и противопоставляют ее полиморфизму. Хотя по общей логике полиморфизм – это частный случай мутации.

Полиморфизм – нейтральная, а точнее безвредная, мутация, которая сравнительно часто встречается у какой-то группы организмов одного вида. Некоторые мутации встречаются часто у всех людей, некоторые – только среди представителей определенных рас или народностей.

Аллель – вариант последовательности гена в разном виде: от различия в одной букве последовательности до отсутствия целого куска последовательности или вставке лишнего. Эти различия возникают из-за мутации, которая могла произойти у далекого предка и передаться потомству через поколения. Таким образом, каждый ген у отдельного человека может быть представлен конкретным вариантом – аллелем. Для понимания аллелизма необходимо объяснить, что, например, различия в цвете глаз, волос, росте, чувствительности к алкоголю объясняются именно разными аллельными состояниями соответствующих генов.

Генотип – это все гены конкретной особи с указанием аллельного состояния каждого гена и наличия/отсутствия мутаций в межгенных участках ДНК.

Доминантный аллель. В геноме человека содержится по 2 копии каждой хромосомы. Это означает, что в каждом геноме есть две очень похожие по длине и последовательности генов молекулы ДНК, которые отличаются аллельными состояниями генов и мутациями/полиморфизмами в межгенных участках этих молекул ДНК. Из этого следует, что и каждый ген представлен в геноме 2 копиями, каждая из которых может быть определенным вариантом (аллелем) этого гена. Доминантным аллелем называется тот, одной копии которого достаточно для проявления его особенностей. То есть если хотя бы на одной из хромосом ген находится в состоянии доминантного аллеля, то ген будет работать по тому варианту, который описывается именно этим аллелем. Важно, что так как у одного гена может быть более двух вариантов (аллелей), то и доминантность аллеля определяется по отношению к каждому из вариантов, хотя есть и те, которые доминантны по сравнению со всеми другими. Встречаются варианты с одинаковой предпочтительностью для работы, тогда проявляется совместное влияние этих вариантов.

Рецессивный аллель – по аналогии с доминантным аллелем, это такое состояние гена, которое наименее предпочтительно для проявления. Поэтому если в геноме есть другая копия гена, доминантная, то задавать темп работы гена будет именно она, но если и вторая копия гена представлена рецессивным аллелем, то будет работать этот, хотя менее предпочтительный, но в такой ситуации единственно имеющийся вариант. Хотя в большинстве случаев связанные с возникновением заболевания аллели рецессивны, это вредность/полезность не является единственным определяющим фактором рецессивности/доминантности аллеля.

Гомозигота. Гомозиготой по определенной мутации/полиморфизму/аллелю называют такую клетку или организм, в генотипе которой/которого обе копии гена на двух хромосомах представлены одним вариантом, то есть не отличаются по этой мутации/полиморфизму/аллелю.

Гетерозигота. Гетерозиготой по определенной мутации/полиморфизму/аллелю называют такую клетку или организм, в генотипе которой/которого две копии гена на двух хромосомах представлены разными вариантами, то есть отличаются по этой мутации/полиморфизму/аллелю.

Секвенирование – это группа методов, позволяющая узнать последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. Этот метод обладает некоторыми особенностями. Во-первых, пока что ни один способ секвенирования не позволяет прочитать всю последовательность одной хромосомы, чтение идет сравнительно небольшими отрезка от 50 до несколько тысяч нуклеотидов. Во-вторых, почти все методы устроены так, что из кусочка ДНК делается много одинаковых и читаются они все. Эта особенность проявляется в таком параметре секвенирования, как глубина секвенирования, обозначаемая 10Х, 20Х, 50Х. Чем больше это значение, тем больше раз прочитан один и тот же кусок молекулы, тем точнее можно выявить ошибки секвенирования и особенности участка, например, его гетерозиготность по какой-либо мутации/полиморфизму.

Гаплотип — совокупность состояний/вариантов определенных локусов, которые расположены на одной хромосоме, и вследствие структурных особенностей эти состояния всегда наследуются вместе. То есть, например, если в одном локусе (1) гаплотипа имеется мутация (1А), а в другом (2) имеется уже другая мутация (2M), то именно в таком составе они будут наследоваться (1А2М), а смешанных вариантов (1B2M или 1A2N) не бывает или они относятся к другому гаплотипу.

Гаплогруппа — совокупность особей, имеющих сходный гаплотип по определенным локусам, которые задаются в соответствии с тем, какую задачу нужно решить, определяя гаплогруппу

Митохондриальная ДНК. Если разбираться подробнее и глубже, то генетическая информация одного человека находится не только в 46 хромосомах, располагающихся в специальном отсеке клетки – ядре, но и в клеточных органах митохондриях. У митохондрий в клетке своя задача – преобразовывать энергию, заключенную в химической связи определенных атомов, в более удобную для клетки, то есть они готовят эффективные питательные запасы из разного сырья. Митохондрии довольно сложны, их оболочка хитро устроена, чтобы опасные побочные продукты готовки не могли попасть в остальную часть клетки, поэтому все время таскать туда нужные для их работы белки не слишком продуктивно. Таким образом, у них есть своя ДНК, которая несет информацию о разных особенных белках и РНК, которые нужны именно для работы митохондрии. Такую ДНК называют митохондриальной и она является неотъемлемой и обязательной частью нашего генотипа. Передается она только от мамы, так как сперматозоид для возможности быстро перемещаться и долго оставаться живым несет самый минимум необходимой генетической информации – 23 хромосомы. А вот яйцеклетка, которой для выполнения основной функции не нужно находится в агрессивной окружающей среде, может позволить себе бОльшую массу и дополнительные запасы в виде готовых к работе станций приготовления питания – митохондрий и заранее синтезированных белков и РНК.

Гены половой дифференцировки – группа генов, играющая ведущую роль в определении будет эмбрион развиваться как девочка или как мальчик. В геноме человека основой проявления мужских или женских половых признаков является наличие/отсутствие половой хромосомы Y, а именно особо локуса этой хромосомы – SRY (Sex-determining Region on the Y chromosome). Важно отметить, что нарушения в этом локусе могут приводить не к внешним проявлениям, а к сниженной репродуктивной способности мужчины или ее полному отсутствию. Процесс дифференцировки пола у человека можно представить тремя стадиями: 1) какой набор хромосом получается при слиянии яйцеклетки (всегда несет хромосому X) и сперматозоида (с хромосомой X или Y), 2) формирование женских или мужских половых органов в зависимости от работы генов локуса SRY, 3) развитие вторичных половых органов в соответствии с типом половых органов. Нарушения на разных этапах приводят к разным проявлениям и разным заболеваниям.

Локус AZF – это участок Y-хромосомы, на котором располагаются так называемые факторы азооспермии (AZF — AZoospermia Factors). Это особые участки, которые названы так, потому что если какой-то из них отсутствует из-за мутации, то развивается азооспермия (отсутствие сперматозоидов) или олигозооспермия (малое количество сперматозоидов). Всего обнаружено три таких фактора AZFa, AZFb и AZFc. В норме наличие всех трех является минимальным необходимым условием нормального формирования сперматозоидов. Если в геноме отсутствует один из AZFa и AZFb или оба, то нарушается созревание сперматозоидов и, как следствие, полностью отсутствует репродуктивная функция. При отсутствии локуса AZFc нарушения могут быть не столь сильными, поэтому деторождение остается возможным в некоторых случаях.

Хромосомные аномалии – это крупные мутации, которые связаны с изменением последовательности ДНК не в рамках отдельного гена или нескольких, а в масштабе хромосомы или генома. Например, отсутствие (делеция) большой части или всей хромосомы, лишняя хромосома, или часть одной хромосомы соединена с частью другой хромосомы и т.д.

Наследственное заболевание – это заболевание, вызванное нарушениями в геноме, то есть мутациями, которые либо мешают формированию нормального белка (так как ген – инструкция по его построению – поврежден), либо изменяют регуляцию, то есть условия, когда, в каком месте или с кем такой белок или ген должен работать.

Моногенное заболевание – это наследственное заболевание, вызванное мутацией в одном только в одном гене. Несмотря на то, что все остальные почти 30000 генов могут быть в порядке, изменение последовательности ДНК в этом гене вызывает нарушения функционирования всего организма.

Хромосомное заболевание – наследственное заболевание, вызванное хромосомными аномалиями.

Носительство мутации – это состояние гетерозиготы по аллелю, обладающему какими-то негативными клиническими проявлениями, если он находится в геноме в виде гомозиготы.

Пробанд – человек, с которого начинается составление генеалогического дерева (родословной). Обычно пробанд – это носитель или пациент с наследственным заболеванием, проявление которого и вызвало необходимость генеалогического анализа.

Сиблинг – в генетике таким термином обозначают потомков одних родителей, то есть братьев и сестер, но не близнецов.

Автор: Жикривецкая Светлана

Биолог-исследователь

Ki-67 (MIB-1) экспрессия, иммуногистохимическое исследование (оценка пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 (MIB-1); Ki-67 (MIB-1) by Immunohistochemistry, IHC)

Метод определения
Гистологическое исследование биоптатов опухоли согласно гистологической классификации ВОЗ с окрашиванием гематоксилином-эозином.
Иммуногистохимическое исследование индекса пролиферативной активности с применением моноклональных антител к Ki-67 (MIB-1) (пероксидазный и авидин-биотиновый методы).

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Комплексное исследование биоптатов, включающее морфологическое описание и оценку пролиферативной активности клеток, которое используют в целях диагностики − определения биологического потенциала новообразований человека.

В современной онкоморфологии ведется поиск критериев, позволяющих верифицировать степень гистологической и биологической злокачественности с максимальной объективностью. Учитывая, что пролиферативная активность клеток опухолей человека коррелирует со степенью их гистологической и биологической злокачественности, в последние годы ИГХ-определение индекса пролиферации при исследовании экспрессии Ki-67 (MIB-1) является необходимым рутинным исследованием при онкологических заболеваниях.

Специфичным и оптимальным для широкого использования в патологоанатомической практике маркером пролиферации является антиген Ki-67. Ядерный антиген Кi-67 впервые описан Gerdes и соавторами в 1983 году, он состоит из двух полипептидных цепей с молекулярной массой 345 и 395 кДа. Это основная часть нуклеарного матрикса, в течение интерфазы ассоциированная с хромосомами фазы митоза. Ki-67−димерная молекула, имеющая тесную связь с 10-й хромосомой, конкретная роль этого протеина в процессе клеточного деления до сих пор точно не выяснена. Экспрессия Кi-67 позволяет выделить опухолевые клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла, на всём его протяжении (G1-, S-, G2- и M-фазы). Кi-67 отсутствует только в G0-периоде. Активно пролиферирующие опухолевые клетки представляют собой «фракцию роста» новообразования. Пролиферативная активность является ведущим фактором как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. Это одна из наиболее важных характеристик фенотипа опухоли, в значительной степени определяющая скорость роста новообразования, риск метастазирования, потенциальный ответ на лечебные мероприятия и исход онкологического заболевания. Многие факторы, влияющие на течение и исход онкологических заболеваний, свое патогенетическое действие на опухоль опосредуют через изменение пролиферативной активности.

Оценивать пролиферативную активность опухолевых клеток необходимо не только для определения биологических характеристик опухолей, но и для селективного подхода к выбору терапии.

Индекс пролиферативной активности в различных опухолях имеет разные значения, являясь при этом независимым прогностическим признаком, определяющим клиническое течение и прогноз заболевания. При Ki-67 менее 15% опухоль считается менее агрессивной, при показателе более 30% опухоль считается высоко агрессивной. При высоком уровне (выраженном в %) Ki-67 опухоль с более высокой вероятностью ответит на химиотерапевтическое лечение. При низком его уровне опухоль, например, молочной железы, при определённых условиях лучше отреагирует на гормонотерапию.

Литература

Волченко Н.Н., Франк Г.А. Комплекс морфологических и прогностических факторов при раке молочной железы: Пособие для врачей. − М., 2000.

Иммуногистохимические методы: руководство. Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова // М., 2011, – 224 с.

Пожарисский К.М., Леенман Е.Н. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний Арх. патол., 2000; (5): 3–11.

Schmitt С.A., Love S.W. Apoptosis and therapy. G. Path., 1999; 187: 127–37.

Viale G., Regan M.M., Mastropasqua M.G. et al. Predictive value of tumor Ki-67 expression in two randomized trials of adjuvant chemoendocrine therapy for node-negative breast cancer // J. Natl Cancer Inst. 2009. Vol. 100 (3). Р. 207–212.

WHO Classification of Tumors of the Braest. WHO, Lyon, 2012.

Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M., et al. Ki-67 in breast cancer: prognostic and predictive potential // Lancet Oncol. 2010. Vol. 11 (2). Р. 174–183.

Анализ экспрессии генов в крови как дополнительный инструмент мониторинга терапии метотрексатом больных ревматоидным артритом | Chetina

1. <div>Насонов ЕЛ, Каратеев ДЕ, Балабанова РМ. Ревматоидный артрит. Ревматология. Национальное руководство. Насонов ЕЛ, Насонова ВА, редакторы. Москва: ГЭОТАР-Медиа; 2008: С. 290–331. [Nasonov EL, Karateev DE, Balabanova RM. Revmatoidnyi artrit. Revmatologiya. Natsional’noe rukovodstvo. Nasonov EL, Nasonova VA, redaktory. Moskva: GEOTAR-Media; 2008: S. 290–331.]Harris ED Jr. Rheumatoid Arthritis: pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 1990;322(18):1277–89. DOI: http://dx.doi.org/10.1056/NEJM199005033221805.Firenstein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 2003;423(6937):356–61. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/nature01661.Rindfleisch JA, Muller D. Diagnosis and management of rheumatoid arthritis. Am Fam Physician. 2005;72(6):1037–47.Visser H, le Cessie S, Vos K, et al. How to diagnose rheumatoid arthritis early: a prediction model for persistent (erosive) arthritis. Arthritis Rheum. 2002;46(2):357–65. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.10117.Machold KP, Stamm TA, Nell VP, et al. Very recent onset rheumatoid arthritis: clinical and serological patient characteristics associated with radiographic progression over the first years of disease. Rheumatology (Oxford). 2007;46(2):342–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/kel237.van Gaalen FA, Linn-Rasker SP, van Venrooij WJ, et al. Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 2004;50(3):709–15. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.20044.Polzer K, Baeten D, Soleiman A, et al. Tumour necrosis factor blockade increases lymphangiogenesis in murine and human arthritic joints. Ann Rheum Dis. 2008;67(11):1610–6. DOI: 10.1136/ard.2007.083394.Tchetina EV, Squires G, Poole AR. Increased type II collagen degradation and very early focal cartilage degeneration is associated with upregulation of chondrocyte differentiation related genes in early human articular cartilage lesions. J Rheumatol. 2005;32(5):876–86.Karouzakis E, Neidhart M, Gay RE, Gay S. Molecular and cellular basis of rheumatoid joint destruction. Immunology Letters. 2006;106(1):8–13. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.imlet.2006.04.011.Grcevic D, Jajic Z, Kovacic N, et al. Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins, tumor necrosis factor-superfamily molecules, and transcription factor Runx2 could be used as markers of the form of arthritis, disease activity, and therapeutic responsiveness. J Rheumatol. 2010;37(2):246–56. DOI: 10.3899/jrheum.090167.Olsen N, Sokka T, Seehorn CL, et al. A gene expression signature for recent onset rheumatoid arthritis in peripheral blood mononuclear cells. Ann Rheum Dis. 2004;63(11):1387–92. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.2003.017194.Van der Pouw Kraan TC, Wijbrandts CA, et al. Rheumatoid arthritis subtypes identified by genomic profiling of peripheral blood cells: assignment of a type I interferon signature in a subpopulation of patients. Ann Rheum Dis. 2007;66(8):1008–14. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.2006.063412.Haas CS, Creighton CJ, Pi X, et al. Identification of genes modulated in rheumatoid arthritis using complementary DNA microarray analysis of lymphoblastoid B cell lines from disease-discordant monozygotic twins. Arthritis Rheum. 2006;54(7):2047–60. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.21953.Tchetina ЕV, Demidova NV, Semyonova LA, et al. Differential expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) in the peripheral blood of early-stage rheumatoid arthritis patients as a prognostic marker of the disease activity and knee joint destruction: a two year follow-up study. Ann Rheum Dis. 2010;69 Suppl 3:675.Четина ЕВ, Демидова НВ, Каратеев ДЕ, Насонов ЕЛ. Гетерогенность первичных больных ревматоидным артритом по экспрессии генов в крови: теоретические основы дифференциального подхода к терапии. Научно-практическая ревматология. 2011;(4):24–30. [Chetina EV, Demidova NV, Karateev DE, Nasovov EL. Heterogeneity of early rheumatoid arthritis patients according to blood gene expression: theoretical bases of a differential therapy approach. Rheumatology Science and Practice. 2011;(4):24–30.]. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2011-57.Четина ЕВ, Семенова ЛА, Логунов АЛ и др. Повышенная экспрессия регуляторных генов в крови и суставном хряще больных ревматоидным артритом. Научно-практическая ревматология. 2012;(4):44–8. [Chetina EV, Semyonova LA, Logunov AL, et al. Enhanced regulatory gene expressions in the blood and articular cartilage of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology Science and Practice. 2012;(4):44–8.]. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2012-1111.Hay N, Sonnenberg N. Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev. 2004;18(16):1926–45. DOI: http://dx.doi.org/10.1101/gad.1212704.Heitman J, Movva NR, Hall MN. Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast. Science. 1991;253(5022):905–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.1715094.Yoshimura N, Ohmoto Y, Yasui H, et al. The direct effect of FK506 and rapamycin on interleukin 1(beta) and immunoglobulin production in vitro. Transplantation. 1994;57(12):1815–8.Foey AD, Feldmann M, Brennan FM. CD40 ligation induces macrophage IL-10 and TNF-alpha production: differential use of the PI3K and p42/44 MAPK-pathways. Cytokine. 2001;16(4):131–42. DOI: http://dx.doi.org/10.1006/cyto.2001.0954.Carlson RP, Hartman DA, Tomchek LA, et al. Rapamycin, a potential disease-modifying antiarthritic drug. J Pharmacol Exp Ther. 1993;266(2):1125–38.Lum JJ, DeBerardinis RJ, Thompson CB. Autophagy in metazoans: cell survival in the land of plenty. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6(6):439–48. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/nrm1660.Lleo A, Invernizzi P, Selmi C, et al. Autophagy: highlighning a novel player in the autoimmunity scenario. J Autoimmun. 2007;29(2–3):61–8. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.jaut.2007.06.003.Lu B, Capan E, Li C. Autophagy induction and autophagic cell death in effector T cells. Autophagy. 2007;3(2):158–9.Boya P, Gonzalez-Polo RA, Casares N, et al. Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol. 2005;25(3):1025–40. DOI: http://dx.doi.org/10.1128/MCB.25.3.1025-1040.2005.Shin YJ, Han SH, Kim DS, et al. Autophagy induction and CHOP under-expression promotes survival of fibroblasts from rheumatoid arthritis patients under endoplasmic reticulum stress. Arthritis Res Ther. 2010;12(1):R19. DOI: 10.1186/ar2921.Catrina AI, Ulfgren AK, Lindblad S, et al. Low levels of apoptosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis synovium. Ann Rheum Dis. 2002;61(10):934–6. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.61.10.934.Rasa K, Scheel-Toellner D, Lee C-Y, et al. Synovial fluid apoptosis is inhibited in patients with very early rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2006;8(4):R120. DOI: http://dx.doi.org/10.1186/ar2009.Eguchi K. Apoptosis in autoimmune diseases. Intern Med. 2001;40(4):275–84. DOI: http://dx.doi.org/10.2169/internalmedicine.40.275.Welsing PM, van Gestel AM, Swinkels HL, et al. The relationship between disease activity, joint destruction, and functional capacity over the course of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2001;44(9):2009–17. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/1529-0131(200109)44:9%3C2009::AID-ART349%3E3.0.CO;2-L.Grassi F, Cristino S, Toneguzzi S, et al. CXCL12 chemokine up-regulates bone resorption and MMP-9 release by human osteoclasts: CXCL12 levels are increased in synovial and bone tissue of rheumatoid arthritis patients. J Cell Physiol. 2004;199(2):244–51. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/jcp.10445.Kaneko M, Tomita T, Nakase T, et al. Expression of proteinases and inflammatory cytokines in subchondral bone regions in the destructive joint of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 2001;40(3):247–55. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/40.3.247.Kim KS, Choi HM, Lee YA, et al. Expression levels and association of gelatinases MMP-2 and MMP-9 and collagenases MMP-1 and MMP-13 with VEGF in synovial fluid of patients with arthritis. Rheumatol Int. 2011;31(4):543-7. DOI: 10.1007/s00296-010-1592-1.Chia WT, Chen YW, Cheng LY, et al. MMP-9 mRNA as a therapeutic marker in acute and chronic stages of arthritis induced by type II collagen antibody. J Formos Med Assoc. 2008;107(3):245–52. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0929-6646(08)60143-6.Senolt L, Grigorian M, Lukanidin E, et al. S100A4 is expressed at site of invasion in rheumatoid arthritis synovium and modulates production of matrix metalloproteinases. Ann Rheum Dis. 2006;65(12):1645–8. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.2005.047704.Di Girolamo N, Indoh I, Jackson N, et al. Human mast cell-derived gelatinase B (matrix metalloproteinase-9) is regulated by inflammatory cytokines: role in cell migration. J Immunol. 2006;177(4):2638–50.Burrage PS, Mix KS, Brinckerhoff CE. Matrix metalloproteinases: role in arthritis. Front Biosci. 2006;11:529–43. DOI: http://dx.doi.org/10.2741/1817.Richardson VJ. Divergent and synergistic regulation of matrix metalloprotease production by cytokines in combination with C-C chemokines. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010;23(3):715–26.Huang JL, Wu SY, Xie XJ, et al. Inhibiting effects of Leflunomide metabolite on overexpression of CD147, MMP-2 and MMP-9 in PMA differentiated THP-1 cells. Eur J Pharmacol. 2011;670(1):304–10. DOI: 10.1016/j.ejphar.2011.07.045.Vandooren B, Kruithof E, Yu DT, et al. Involvement of matrix metalloproteinases and their inhibitors in peripheral synovitis and down-regulation by tumor necrosis factor alpha blockade in spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 2004;50(9):2942–53. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.20477.Matsushita I, Uzuki M, Matsuno H, et al. Rheumatoid nodulosis during methotrexate therapy in a patient with rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol. 2006;16(6):401–3. DOI: http://dx.doi.org/10.1007/s10165-006-0522-2.Prevoo ML, van ‘t Hof MA, Kuper HH, et al. Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1995;38(1):44–8. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.1780380107.Prevoo ML, van Gestel AM, van T Hof MA, et al. Remission in a prospective study of patients with rheumatoid arthritis. American Rheumatism Association preliminary remission criteria in relation to the disease activity score. Br J Rheumatol. 1996;35(11):1101–5. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/35.11.1101.Van der Heijde DM. How to read radiographs according to the Sharp/van der Heijde method. J Rheumatol. 1999;26(3):743–5.Van der Heijde DM, Dankert T, et al. Reliability and sensitivity to change of a simplification of the Sharp/van der Heijde radiological assessment in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 1999;38(10):941–7. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/38.10.941.Четина ЕВ, ДиБатиста Д, Пул АР. Роль простагландина E2 в ингибировании разрушения коллагена суставного хряща больных остеоартрозом. Научно-практическая ревматология. 2009;(3):18–24. [Chetina EV, DiBattista D, Pool AR. Prostaglandin E2 role in inhibition of joint cartilage collagen destruction in patients with osteoarthritis. Rheumatology Science and Practice. 2009;(3):18–24.]. DOI: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2009-1308.Weinblatt ME, Kaplan H, Germain BF, et al. Methotrexate in rheumatoid arthritis. A five-year prospective multicenter study. Arthritis Rheum. 1994;37(10):1492–8. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.1780371013.Machold KP, Stamm TA, Nell VP, et al. Very recent onset rheumatoid arthritis: clinical and serological patient characteristics associated with radiographic progression over the first years of disease. Rheumatology (Oxford). 2007;46(2):342–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/kel237.Schett G, Stach C, Zwerina J, et al. How antirheumatic drugs protect joints from damage in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008;58(10):2936–48. DOI: 10.1002/art.23951.Gossec L, Dougados M, Goupille P, et al. Prognostic factors for remission in early rheumatoid arthritis: a multiparameter prospective study. Ann Rheum Dis. 2004;63(6):675–80. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.2003.010611.Mottonen T, Paimela L, Leirisalo-Repo M, et al. Only high disease activity and positive rheumatoid factor indicate poor prognosis in patients with early rheumatoid arthritis treated with «sawtooth» strategy. Ann Rheum Dis. 1998;57(9):533–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.57.9.533.Eberhardt K, Fex E. Clinical course and remission rate in patients with early rheumatoid arthritis: relationship to outcome after 5 years. Br J Rheumatol. 1998;37(12):1324–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1093/rheumatology/37.12.1324.Forslind K, Hafstrom I, Ahlmen M, et al.; BARFOT Study Group. Sex: a major predictor of remission in early rheumatoid arthritis? Ann Rheum Dis. 2007;66(1):46–52. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.2006.056937.Morgan C, Lunt M, Brightwell H, et al. Contribution of patient related differences to multidrug resistance in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2003;62(1):15–9. DOI: http://dx.doi.org/10.1136/ard.62.1.15.Hider SL, Silman AJ, Thomson W, et al. Can clinical factors at presentation be used to predict outcome of treatment with methotrexate in patients with early inflammatory polyarthritis? Ann Rheum Dis. 2009;68(1):57–62. DOI: 10.1136/ard.2008.088237.Saevarsdottir S, Wallin H, Seddighzadeh M, et al.; SWEFOT Trial Investigators Group. Predictors of response to methotrexate in early DMARD naive rheumatoid arthritis: results from the initial open-label phase ofthe SWEFOT trial. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):469–75. DOI: 10.1136/ard.2010.139212.Vazquez I, Graell E, Gratacos J, et al. Prognostic markers of clinical remission in early rheumatoid arthritis after two years of DMARDs in a clinical setting. Clin Exp Rheumatol. 2007;25(2):231–8.Ma MH, Ibrahim F, Walker D, et al. Remission in early rheumatoid arthritis: predicting treatment response. J Rheumatol. 2012;39(3):470–5. DOI: 10.3899/jrheum.110169.Mottonen T, Hannonen P, Korpela M, et al.; FIN-RACo Trial Group. FINnish Rheumatoid Arthritis Combination therapy. Delay to institution of therapy and induction of remission using single-drug or combination-disease-modifying antirheumatic drug therapy in early rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2002;46(4):894–8. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.10135.Combe B, Cantagrel A, Goupille P, et al. Predictive factors of 5-year health assessment questionnaire disability in early rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 2003;30(11):2344–9.Hodkinson B, Musenge E, Ally M, et al. Response to traditional disease-modifying anti-rheumatic drugs in indigent South Africans with early rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2011;31(4):613–9. DOI: 10.1007/s10067-011-1900-5.Cao Y, Bonner A, Barra LJ. Response to second-line DMARDs and TNFi in seropositive and seronegative patientsin early and late rheumatoid arthritis are not the same: results from the CATCH cohort and a large, established rheumatoid arthritis database [abstract]. Arthritis Rheum. 2011;63 Suppl 10):2202.Verschueren P, Esselens G, Westhovens R. Predictors of remission, normalized physical function, and changes in the working situation during follow-up of patients with early rheumatoid arthritis: an observational study. Scand J Rheumatol. 2009;38(3):166–72. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/03009740802484846.Wessels JA, van der Kooij SM, le Cessie S, et al; Pharmacogenetics Collaborative Research Group. A clinical pharmacogenetic model to predict the efficacy of methotrexate monotherapy in recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2007;56(6):1765–75. DOI: http://dx.doi.org/10.1002/art.22640.Mori S, Hirose J, Yonemura K. Contribution of HLA-DRB1*04 alleles and anti-cyclic citrullinated antibodies to development of resistance to disease-modifying antirheumatic drugs in early rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2010;29(12):1357–66. DOI: 10.1007/s10067-010-1454-y.Knowlton N, Jiang K, Frank MB, et al. The meaning of clinical remission in polyarticular juvenile idiopathic arthritis: gene expression profiling in peripheral blood mononuclear cells identifies distinct disease states. Arthritis Rheum. 2009;60(3):892–900. DOI: 10.1002/art.24298.</div>

Что такое экспрессия гена? | Факты

Экспрессия гена — это процесс, с помощью которого инструкции в нашей ДНК преобразуются в функциональный продукт, такой как белок.

Когда информация, хранящаяся в нашей ДНК, преобразуется в инструкции по созданию белков или других молекул, это называется экспрессией генов.
Экспрессия гена — это строго регулируемый процесс, который позволяет клетке реагировать на изменение окружающей среды.
Он действует как переключатель включения / выключения для управления производством белков, а также как регулятор объема, который увеличивает или уменьшает количество производимых белков.
Есть два ключевых этапа создания белка: транскрипция и трансляция.

Транскрипция

Транскрипция — это когда ДНК в гене копируется для получения транскрипта РНК, называемого информационной РНК (мРНК).
Это осуществляется ферментом, называемым РНК-полимеразой, который использует доступные основания из ядра клетки для формирования мРНК.
РНК — это химическое вещество, сходное по структуре и свойствам с ДНК, но оно имеет только одну цепь оснований, а вместо основания тимина (T) РНК имеет основание, называемое урацилом (U).

Иллюстрация, показывающая процесс транскрипции.
Изображение предоставлено: Genome Research Limited

Трансляция

Трансляция происходит после того, как информационная РНК (мРНК) передала транскрибированное «сообщение» от ДНК к фабрикам по производству белка в клетке, называемым рибосомами.
Сообщение, переносимое мРНК, считывается молекулой-носителем, называемой транспортной РНК (тРНК).
МРНК считывается по трем буквам (кодону) за раз.
Каждый кодон определяет конкретную аминокислоту. Например, три основания «GGU» кодируют аминокислоту под названием глицин.
Поскольку существует только 20 аминокислот, но 64 потенциальных комбинации кодонов, более одного кодона могут кодировать одну и ту же аминокислоту. Например, кодоны «GGU» и «GGC» кодируют глицин.
Каждая аминокислота специфически прикрепляется к своей собственной молекуле тРНК.
Когда последовательность мРНК считывается, каждая молекула тРНК доставляет свою аминокислоту на рибосому и временно связывается с соответствующим кодоном на молекуле мРНК.
После связывания тРНК высвобождает свою аминокислоту, и все соседние аминокислоты объединяются в длинную цепь, называемую полипептидом.
Этот процесс продолжается до образования белка.
Белки выполняют большинство активных функций клетки.

Иллюстрация, показывающая процесс перевода.
Изображение предоставлено: Genome Research Limited

Эта страница последний раз обновлялась 25.01.2016

Изучение экспрессии и функции генов — молекулярная биология клетки

В конечном счете, нужно определить, как гены — и белки, которые они кодируют, — функционируют в интактном организме.Хотя это может показаться нелогичным, один из самых прямых способов узнать, что делает ген, — это посмотреть, что происходит с организмом, когда этот ген отсутствует. Изучение мутантных организмов, которые приобрели изменения или делеции в своих нуклеотидных последовательностях, является освященной веками практикой в биологии. Поскольку мутации могут прерывать клеточные процессы, мутанты часто являются ключом к пониманию функции генов. При классическом подходе к важной области генетики каждый начинает с выделения мутантов, которые имеют интересный или необычный внешний вид: например, дрозофилы с белыми глазами или фигурными крыльями.Работая в обратном направлении от фенотипа — внешнего вида или поведения индивидуума, — затем определяют генотип организма, форму гена, ответственного за эту характеристику (панель 8-1).

Сегодня, когда многочисленные проекты генома добавляют десятки тысяч нуклеотидных последовательностей в общедоступные базы данных каждый день, исследование функции генов часто начинается с последовательности ДНК. Здесь задача состоит в том, чтобы преобразовать последовательность в функцию. Один из подходов, обсуждавшихся ранее в этой главе, заключается в поиске в базах данных хорошо охарактеризованных белков, которые имеют аминокислотные последовательности, сходные с белком, кодируемым новым геном, и оттуда использовать некоторые из методов, описанных в предыдущем разделе, для изучения генов. работать дальше.Но для непосредственного решения проблемы того, как ген функционирует в клетке или организме, наиболее эффективный подход включает изучение мутантов, у которых либо отсутствует ген, либо выражена его измененная версия. Затем определение того, какие клеточные процессы были нарушены или нарушены у таких мутантов, часто дает возможность увидеть биологическую роль гена.

В этом разделе мы описываем несколько различных подходов к определению функции гена, независимо от того, начинается ли он с последовательности ДНК или от организма с интересным фенотипом.Начнем с классического генетического подхода к изучению генов и функций генов. Эти исследования начинаются с генетического скрининга для выделения представляющих интерес мутантов, а затем переходят к идентификации гена или генов, ответственных за наблюдаемый фенотип. Затем мы рассматриваем набор методов, которые подпадают под действие обратной генетики , в которой один начинается с гена или последовательности гена и пытается определить его функцию. Этот подход часто включает в себя некоторые разумные догадки — поиск гомологичных последовательностей и определение того, когда и где экспрессируется ген, — а также создание мутантных организмов и характеристику их фенотипа.

Классический подход начинается со случайного мутагенеза

До появления технологии клонирования генов большинство генов было идентифицировано процессами, нарушенными при мутации гена. Этот классический генетический подход — определение генов, ответственных за мутантные фенотипы, — наиболее легко реализуется у организмов, которые быстро размножаются и поддаются генетическим манипуляциям, таких как бактерии, дрожжи, нематодные черви и плодовые мухи. Хотя спонтанные мутанты иногда можно обнаружить, исследуя чрезвычайно большие популяции — тысячи или десятки тысяч отдельных организмов, — процесс выделения мутантов можно сделать гораздо более эффективным, создав мутации с помощью агентов, повреждающих ДНК.Обработка организмов мутагенами позволяет быстро создать очень большое количество мутантов, а затем провести их скрининг на конкретный интересующий дефект, как мы вскоре увидим.

Альтернативный подход к химическому или радиационному мутагенезу называется инсерционным мутагенезом . Этот метод основан на том факте, что экзогенная ДНК, случайно вставленная в геном, может вызывать мутации, если вставленный фрагмент прерывает ген или его регуляторные последовательности. Вставленная ДНК, последовательность которой известна, затем служит молекулярной меткой, которая помогает в последующей идентификации и клонировании поврежденного гена ().В Drosophila использование мобильного P-элемента для инактивации генов произвело революцию в изучении функции генов у плодовой мушки. Мобильные элементы (см. Таблицу 5-3, стр. 287) также использовались для создания мутантов у бактерий, дрожжей и цветущих растений Arabidopsis . Ретровирусы, которые копируют себя в геном хозяина (см.), Использовались для нарушения работы генов у рыбок данио и мышей.

Рис. 8-55

Инсерционный мутант львиного зева, Antirrhinum. Мутация в единственном гене, кодирующем регуляторный белок, вызывает развитие листовых побегов вместо цветков. Мутация позволяет клеткам принимать характер, соответствующий другому (подробнее …)

Такие исследования хорошо подходят для анализа биологических процессов у червей и мух, но как мы можем изучать функцию генов у людей? В отличие от организмов, которые мы обсуждали, люди не размножаются быстро, и их не обрабатывают намеренно мутагенами. Более того, любой человек с серьезным дефектом в важном процессе, таком как репликация ДНК, умрет задолго до рождения.

Есть два ответа на вопрос, как мы изучаем гены человека. Во-первых, поскольку гены и функции генов сохранялись на протяжении всей эволюции, изучение менее сложных модельных организмов позволяет получить важную информацию о схожих генах и процессах у людей. Соответствующие гены человека можно затем изучить в культивируемых клетках человека. Во-вторых, многие несмертельные мутации — например, тканеспецифические дефекты лизосом или рецепторов клеточной поверхности — возникли спонтанно в человеческой популяции.Анализ фенотипов пораженных людей вместе с исследованиями их культивируемых клеток позволил получить много уникальных сведений о важных функциях клеток человека. Хотя такие мутации редки, они очень эффективно обнаруживаются благодаря уникальному свойству человека: особи-мутанты привлекают к себе внимание, обращаясь за специальной медицинской помощью.

Генетический скрининг выявляет мутанты, дефицитные в клеточных процессах

После получения коллекции мутантов в модельном организме, таком как дрожжи или мухи, обычно необходимо исследовать тысячи людей, чтобы найти измененный фенотип, представляющий интерес.Такой поиск называется генетическим скринингом. Поскольку получение мутации в интересующем гене зависит от вероятности того, что ген будет инактивирован или иным образом мутирован во время случайного мутагенеза, чем больше размер генома, тем меньше вероятность того, что какой-либо конкретный ген будет мутирован. Следовательно, чем сложнее организм, тем больше мутантов необходимо исследовать, чтобы не пропустить гены. Скрининговый фенотип может быть простым или сложным. Проще всего обнаружить простые фенотипы: например, метаболический дефицит, при котором организм больше не может расти из-за отсутствия определенной аминокислоты или питательного вещества.

Более сложные фенотипы, например мутации, вызывающие дефекты обучения или памяти, могут потребовать более сложных проверок (). Но даже генетические скрининги, которые используются для анализа сложных физиологических систем, должны быть как можно более простыми по конструкции и, если возможно, должны позволять исследовать большое количество мутантов одновременно. Например, один особенно элегантный экран был разработан для поиска генов, участвующих в визуальной обработке у рыбок данио. В основе этого экрана, который отслеживает реакцию рыб на движение, лежит изменение поведения.Рыбы дикого типа имеют тенденцию плыть в направлении предполагаемого движения, в то время как мутанты с дефектами зрительной системы плавают в случайных направлениях — поведение, которое легко обнаружить. Один мутант, обнаруженный на этом экране, называется lakritz , в нем отсутствуют 80% ганглиозных клеток сетчатки, которые помогают передавать визуальные сигналы из глаза в мозг. Поскольку клеточная организация сетчатки рыбок данио отражает таковую у всех позвоночных, изучение таких мутантов также должно дать представление о визуальной обработке у людей.

Рисунок 8-56

Экраны могут обнаруживать мутации, влияющие на поведение животного. (A) Дикий тип C. elegans участвует в социальном питании. Черви плавают, пока не встретят своих соседей и не начнут кормиться. (B) Животные-мутанты питаются сами по себе. (Любезно предоставлено Корнелией (подробнее …)

Поскольку дефекты генов, которые необходимы для фундаментальных клеточных процессов — например, синтеза и обработки РНК или контроля клеточного цикла — обычно смертельны, функции этих генов часто изучаются при температуре -чувствительные мутанты.У этих мутантов белковый продукт мутантного гена нормально функционирует при средней температуре, но может быть инактивирован небольшим повышением или понижением температуры. Таким образом, отклонение от нормы можно включать и выключать экспериментально, просто изменяя температуру. Клетка, содержащая чувствительную к температуре мутацию в гене, необходимом для выживания при недопустимой температуре, тем не менее, может расти при нормальной или допустимой температуре (). Чувствительный к температуре ген у такого мутанта обычно содержит точечную мутацию, которая вызывает незначительное изменение его белкового продукта.

Рисунок 8-57

Скрининг чувствительных к температуре бактериальных или дрожжевых мутантов. Мутагенизированные клетки высевают при разрешающей температуре. Полученные колонии переносят в две идентичные чашки Петри путем повторного посева; один из этих планшетов инкубируется при (подробнее …)

Многие чувствительные к температуре мутанты были выделены в генах, которые кодируют бактериальные белки, необходимые для репликации ДНК, путем скрининга популяций обработанных мутагеном бактерий на предмет клеток, которые перестают производить ДНК, когда они разогреваются от 30 ° С до 42 ° С.Эти мутанты позже были использованы для идентификации и характеристики соответствующих белков репликации ДНК (обсуждаемых в главе 5). Чувствительные к температуре мутанты также привели к идентификации многих белков, участвующих в регуляции клеточного цикла и в перемещении белков по секреторному пути у дрожжей (см. Панель 13-1). Соответствующие подходы к скринингу продемонстрировали функцию ферментов, участвующих в основных метаболических путях бактерий и дрожжей (обсуждаемых в главе 2), а также выявили многие из продуктов генов, ответственных за упорядоченное развитие эмбриона Drosophila (обсуждается в главе 21).

Тест комплементации выявляет две мутации в одном и том же гене или в разных генах

Крупномасштабный генетический скрининг может выявить множество разных мутантов, которые демонстрируют один и тот же фенотип. Эти дефекты могут лежать в разных генах, которые функционируют в одном процессе, или они могут представлять разные мутации в одном и том же гене. Тогда как мы можем определить, происходят ли две мутации, вызывающие один и тот же фенотип, в одном и том же гене или в разных генах? Если мутации рецессивные — если, например, они представляют собой потерю функции определенного гена, — можно использовать тест комплементации, чтобы установить, относятся ли мутации к одному или к разным генам.В простейшем типе теста комплементации индивид, гомозиготный по одной мутации, т. Е. Обладающий двумя идентичными аллелями рассматриваемого мутантного гена, скрещивается с индивидом, гомозиготным по другой мутации. Если две мутации находятся в одном и том же гене, потомство демонстрирует мутантный фенотип, потому что у них все еще не будет нормальных копий рассматриваемого гена (см. Панель 8-1, стр. 526-527). Если, напротив, мутации попадают в разные гены, полученное потомство демонстрирует нормальный фенотип.Они сохраняют одну нормальную копию (и одну мутантную копию) каждого гена. Таким образом, мутации дополняют друг друга и восстанавливают нормальный фенотип. Тестирование комплементации мутантов, идентифицированных во время генетического скрининга, показало, например, что дрожжам требуется 5 генов для переваривания сахарной галактозы; что 20 генов необходимы для E. coli , чтобы построить функциональный жгутик; что 48 генов участвуют в сборке вирусных частиц бактериофага Т4; и что сотни генов участвуют в развитии взрослого червя нематоды из оплодотворенного яйца.

После идентификации набора генов, участвующих в конкретном биологическом процессе, следующим шагом является определение порядка их функционирования. Определение того, когда действует ген, может облегчить реконструкцию целых генетических или биохимических путей, и такие исследования занимают центральное место в нашем понимании метаболизма, передачи сигналов и многих других процессов развития и физиологических процессов. По сути, выяснение порядка, в котором функционируют гены, требует тщательной характеристики фенотипа, вызванного мутациями в каждом отдельном гене.Представьте, например, что мутации в нескольких генах вызывают остановку деления клеток на раннем этапе развития эмбриона. Внимательное изучение каждого мутанта может показать, что некоторые из них действуют очень рано, не позволяя оплодотворенной яйцеклетке делиться на две клетки. Другие мутации могут способствовать раннему делению клеток, но не позволяют эмбриону достичь стадии бластулы.

Чтобы проверить прогнозы, касающиеся порядка функционирования генов, можно создать организмы, мутантные по двум разным генам.Если эти мутации влияют на две разные стадии одного и того же процесса, такие двойные мутанты должны иметь фенотип, идентичный фенотипу мутации, которая действует раньше всего на этом пути. Например, таким образом был расшифрован путь секреции белка у дрожжей. Различные мутации в этом пути вызывают аберрантное накопление белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER) или в аппарате Гольджи. Когда клетка сконструирована так, чтобы нести как мутацию, которая блокирует процессинг белка в ER , так и мутацию , которая блокирует процессинг в компартменте Гольджи, белки накапливаются в ER.Это указывает на то, что белки должны пройти через ER перед тем, как попасть в Golgi перед секрецией ().

Рисунок 8-58

Использование генетики для определения порядка функционирования генов. В нормальных клетках белки загружаются в пузырьки, которые сливаются с плазматической мембраной и выделяют свое содержимое во внеклеточную среду. В секреторном мутанте A белки накапливаются в (подробнее …)

Гены могут быть локализованы с помощью анализа сцепления

Следующим шагом с учетом мутантов является идентификация гена или генов, которые, по-видимому, ответственны за измененный фенотип.Если для первоначального мутагенеза использовался инсерционный мутагенез, найти поврежденный ген довольно просто. Фрагменты ДНК, содержащие вставку (например, транспозон или ретровирус), собирают и амплифицируют, и определяют нуклеотидную последовательность фланкирующей ДНК. Эта последовательность затем используется для поиска в базе данных ДНК, чтобы идентифицировать ген, который был прерван вставкой мобильного элемента.

Если для создания мутантов использовалось химическое вещество, повреждающее ДНК, идентификация инактивированного гена часто бывает более трудоемкой и может быть выполнена несколькими различными подходами.Во-первых, первый шаг — определить, где в геноме расположен ген. Чтобы нанести на карту недавно открытый ген, сначала определяют его приблизительное хромосомное положение, оценивая, насколько далеко этот ген находится от других известных генов в геноме. Оценка расстояния между генетическими локусами обычно выполняется с помощью анализа сцепления, метода, который основан на том факте, что гены, расположенные рядом друг с другом на хромосоме, как правило, наследуются вместе. Чем ближе гены, тем больше вероятность, что они будут переданы потомству в паре.Однако даже тесно связанные гены можно разделить путем рекомбинации во время мейоза. Чем больше расстояние между двумя генетическими локусами, тем больше вероятность того, что они будут разделены кроссинговером (см. Панель 8-1, стр. 526–527). Вычислив частоту рекомбинации между двумя генами, можно определить приблизительное расстояние между ними.

Поскольку гены не всегда расположены достаточно близко друг к другу, чтобы можно было точно определить их положение, анализ сцепления часто полагается на физические маркеры вдоль генома для оценки местоположения неизвестного гена.Эти маркеры обычно представляют собой нуклеотидные фрагменты с известной последовательностью и местоположением в геноме, которые могут существовать по крайней мере в двух аллельных формах. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), например, представляют собой короткие последовательности, которые отличаются одним или несколькими нуклеотидами среди людей в популяции. SNP могут быть обнаружены методами гибридизации. Многие такие физические маркеры, распределенные по всей длине хромосом, были собраны для различных организмов, в том числе более 10 ⁶ для людей.Если распределение этих маркеров достаточно плотное, можно с помощью анализа сцепления, который проверяет тесное совпадение одного или нескольких SNP с мутантным фенотипом, сузить потенциальное местоположение гена до хромосомной области, которая может содержать только несколько генные последовательности. Затем они считаются генами-кандидатами, и их структура и функция могут быть протестированы напрямую, чтобы определить, какой ген отвечает за исходный мутантный фенотип.

Аналогичным образом можно использовать анализ сцепления для идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания человека.Такие исследования требуют, чтобы образцы ДНК были собраны у большого количества семей, затронутых болезнью. Эти образцы исследуются на наличие физических маркеров, таких как SNP, которые, по-видимому, тесно связаны с геном болезни — эти последовательности всегда будут унаследованы людьми, которые болеют этим заболеванием, а не их здоровыми родственниками. Затем обнаруживают ген болезни, как описано выше (). Таким образом, например, были открыты гены муковисцидоза и болезни Хантингтона.

Рисунок 8-59

Анализ генетической связи с использованием физических маркеров ДНК для поиска гена человека. В этом примере изучается совместное наследование определенного человеческого фенотипа (в данном случае генетического заболевания) с маркером SNP. Если люди, которые почти всегда наследуют болезнь (подробнее …)

Поиск гомологии может помочь предсказать функцию гена

После идентификации гена его функцию часто можно предсказать, идентифицируя гомологичные гены, функции которых уже известны.Как мы обсуждали ранее, в базах данных, содержащих нуклеотидные последовательности различных организмов, включая полные последовательности генома многих десятков микробов, C. elegans , A. thaliana , D. melanogaster и человека, можно выполнять поиск. для последовательностей, аналогичных последовательностям не охарактеризованного целевого гена.

При анализе вновь секвенированного генома такой поиск служит первой попыткой присвоить функции как можно большему количеству генов, этот процесс называется аннотацией .Затем проводятся дальнейшие генетические и биохимические исследования, чтобы подтвердить, кодирует ли ген продукт с предсказанной функцией, как мы вскоре обсудим. Анализ гомологии не всегда дает информацию о функции: в случае генома дрожжей 30% ранее не охарактеризованных генов можно было бы присвоить предполагаемую функцию путем анализа гомологии; 10% имели гомологи, функция которых также была неизвестна; и еще 30% не имели гомологов ни в одной из существующих баз данных. (Остальные 30% генов были идентифицированы до секвенирования генома дрожжей.)

В некоторых случаях поиск гомологии обнаруживает ген в организме A, который продуцирует белок, который в другом организме слит со вторым белком, который продуцируется независимым геном в организме A. Например, в дрожжах. два отдельных гена кодируют два белка, которые участвуют в синтезе триптофана; в E. coli , однако, эти два гена слиты в один (). Знание о том, что эти два белка в дрожжах соответствуют двум доменам в одном бактериальном белке, означает, что они, вероятно, функционально связаны и, вероятно, работают вместе в белковом комплексе.В более общем плане этот подход используется для установления функциональных связей между генами, которые для большинства организмов широко разделены в геноме.

Рисунок 8-60

Слияние доменов выявляет отношения между функционально сцепленными генами. В этом примере функциональное взаимодействие генов 1 и 2 в организме A предполагается путем слияния гомологичных доменов в один ген (ген 3) в организме B.

Репортерные гены показывают, когда и где экспрессируется ген

Подсказки к функции гена часто можно получить, исследуя, когда и где ген экспрессируется в клетке или во всем организме.Определение структуры и времени экспрессии гена может быть выполнено путем замены кодирующей части исследуемого гена репортерным геном. В большинстве случаев затем отслеживают экспрессию репортерного гена, отслеживая флуоресценцию или ферментативную активность его белкового продукта (стр. 518–519).

Как подробно обсуждается в главе 7, экспрессия генов контролируется регуляторными последовательностями ДНК, расположенными выше или ниже кодирующей области, которые обычно не транскрибируются.Эти регуляторные последовательности, которые контролируют, какие клетки будут экспрессировать ген и при каких условиях, также можно заставить управлять экспрессией репортерного гена. Один просто заменяет кодирующую последовательность целевого гена последовательностью репортерного гена и вводит эти рекомбинантные молекулы ДНК в клетки. Уровень, время и клеточная специфичность продукции репортерного белка отражают действие регуляторных последовательностей, принадлежащих исходному гену ().

Рисунок 8-61

Использование репортерного белка для определения характера экспрессии гена.(A) В этом примере кодирующая последовательность для белка X заменена кодирующей последовательностью для белка Y. (B) Различные фрагменты ДНК, содержащие кандидатные регуляторные последовательности (подробнее …)

Некоторые другие методы, обсуждавшиеся ранее, могут также может использоваться для определения характера экспрессии гена. Методы гибридизации, такие как Нозерн-анализ (см.) И гибридизация in situ и для обнаружения РНК (см.), Могут выявить, когда гены транскрибируются и в какой ткани, и сколько мРНК они продуцируют.

Микромассивы для одновременного мониторинга экспрессии тысяч генов

До сих пор мы обсуждали методы, которые можно использовать для одновременного мониторинга экспрессии только одного гена. Многие из этих методов довольно трудозатратны: создание конструкций репортерного гена или слияния GFP требует манипулирования ДНК и трансфекции клеток полученными рекомбинантными молекулами. Даже Нозерн-анализы ограничены по объему количеством образцов, которые можно запустить на агарозном геле. Разработанные в 1990-х годах ДНК-микроматрицы революционизировали способ анализа экспрессии генов, позволив одновременно контролировать РНК-продукты тысяч генов.Изучая экспрессию стольких генов одновременно, мы можем теперь начать идентифицировать и изучать паттерны экспрессии генов, лежащие в основе клеточной физиологии: мы можем видеть, какие гены включаются (или выключаются) по мере роста клеток, деления или реакции на гормоны или к токсинам.

ДНК-микрочипы — это не что иное, как предметные стекла стеклянного микроскопа, усыпанные большим количеством фрагментов ДНК, каждый из которых содержит нуклеотидную последовательность, которая служит зондом для определенного гена. Наиболее плотные массивы могут содержать десятки тысяч этих фрагментов на площади меньше почтовой марки, что позволяет проводить тысячи реакций гибридизации параллельно ().Некоторые микроматрицы создаются из больших фрагментов ДНК, которые были созданы с помощью ПЦР и затем нанесены на предметные стекла роботом. Другие содержат короткие олигонуклеотиды, которые синтезируются на поверхности стеклянной пластины с помощью методов, аналогичных тем, которые используются для травления схем на компьютерных микросхемах. В любом случае известна точная последовательность и положение каждого зонда на чипе. Таким образом, любой нуклеотидный фрагмент, который гибридизуется с зондом в массиве, может быть идентифицирован как продукт конкретного гена просто путем определения положения, с которым он связан.

Рисунок 8-62

Использование микрочипов ДНК для одновременного мониторинга экспрессии тысяч генов. Для подготовки микроматрицы фрагменты ДНК, каждый из которых соответствует гену, наносятся на предметное стекло с помощью робота. Подготовленные массивы также доступны в продаже. (подробнее …)

Чтобы использовать микроматрицу ДНК для контроля экспрессии генов, сначала извлекают мРНК из исследуемых клеток и конвертируют в кДНК (см.). Затем кДНК метят флуоресцентным зондом. Микроматрицу инкубируют с этим меченым образцом кДНК и дают возможность гибридизации (см.).Затем матрицу промывают для удаления кДНК, которая не связана прочно, и положения в микроматрице, с которыми связаны меченые фрагменты ДНК, идентифицируют с помощью автоматического сканирующего лазерного микроскопа. Затем позиции массива сопоставляются с конкретным геном, образец ДНК которого был обнаружен в этом месте.

Обычно флуоресцентную ДНК из экспериментальных образцов (помеченных, например, красным флуоресцентным красителем) смешивают с эталонным образцом фрагментов кДНК, помеченных флуоресцентным красителем разного цвета (например, зеленым).Таким образом, если количество РНК, экспрессируемой конкретным геном в интересующих клетках, увеличивается по сравнению с контрольным образцом, результирующее пятно становится красным. И наоборот, если экспрессия гена снижена по сравнению с эталонным образцом, пятно становится зеленым. Используя такой внутренний справочник, профили экспрессии генов могут быть сведены в таблицу с большой точностью.

До сих пор микроматрицы ДНК использовались для изучения всего, от изменения экспрессии генов, вызывающего созревание клубники, до «сигнатур» экспрессии генов различных типов раковых клеток человека (см.).Массивы, содержащие зонды, представляющие все 6000 генов дрожжей, использовались для мониторинга изменений, которые происходят в экспрессии генов, когда дрожжи переходят от ферментации глюкозы к росту на этаноле; как они реагируют на внезапный переход к жаре или холоду; и поскольку они проходят через разные стадии клеточного цикла. Первое исследование показало, что по мере того, как дрожжи используют последнюю глюкозу в своей среде, характер их экспрессии генов заметно меняется: около 900 генов транскрибируются более активно, а активность еще 1200 снижается.Около половины этих генов не имеют известной функции, хотя это исследование предполагает, что они каким-то образом участвуют в метаболическом перепрограммировании, которое происходит, когда дрожжевые клетки переходят от ферментации к дыханию.

Всесторонние исследования экспрессии генов также предоставляют дополнительный уровень информации, полезной для прогнозирования функции генов. Ранее мы обсуждали, как определение партнеров по взаимодействию белка может дать ключ к разгадке функции этого белка. Аналогичный принцип верен и для генов: информацию о функции гена можно получить, определив гены, которые имеют общий паттерн его экспрессии.Используя метод под названием кластерный анализ , можно идентифицировать наборы генов, которые скоординированно регулируются. Гены, которые включаются или выключаются вместе при различных обстоятельствах, могут работать в клетке согласованно: они могут кодировать белки, которые являются частью одной и той же мультипротеиновой машины, или белки, которые участвуют в сложной координированной деятельности, например ДНК. репликация или сплайсинг РНК. Характеристика функции неизвестного гена путем объединения его с известными генами, которые разделяют его транскрипционное поведение, иногда называют «чувством вины по ассоциации».Кластерный анализ был использован для анализа профилей экспрессии генов, лежащих в основе многих интересных биологических процессов, включая заживление ран у людей ().

Рис. 8-63

Использование кластерного анализа для идентификации наборов генов, которые координированно регулируются. Гены, принадлежащие к одному кластеру, могут участвовать в общих клеточных путях или процессах. Для проведения кластерного анализа данные микрочипов получают из образцов клеток (подробнее …)

Целевые мутации могут выявить функцию гена

Хотя в быстро воспроизводящихся организмах часто нетрудно получить мутанты, дефицитные в конкретном процессе, таких как репликация ДНК или развитие глаз, может потребоваться много времени, чтобы отследить дефект до конкретного измененного белка.В последнее время технология рекомбинантной ДНК и стремительный рост секвенирования генома сделали возможным использование другого типа генетического подхода. Вместо того, чтобы начинать со случайно сгенерированного мутанта и использовать его для идентификации гена и его белка, можно начать с определенного гена и продолжить в нем мутации, создавая мутантные клетки или организмы для анализа функции гена. Поскольку новый подход меняет традиционное направление генетических открытий — переход от генов и белков к мутантам, а не наоборот — его обычно называют обратной генетикой.

Обратная генетика начинается с клонированного гена, белка с интересными свойствами, который был выделен из клетки, или просто последовательности генома. Если отправной точкой является белок, сначала идентифицируется кодирующий его ген и, при необходимости, определяется его нуклеотидная последовательность. Затем последовательность гена может быть изменена in vitro на для создания мутантной версии. Этот сконструированный мутантный ген вместе с соответствующей регуляторной областью переносится в клетку. Внутри клетки он может интегрироваться в хромосому, становясь постоянной частью генома клетки.Все потомки модифицированной клетки теперь будут содержать мутантный ген.

Если исходной клеткой, использованной для переноса гена, является оплодотворенная яйцеклетка, можно получить целые многоклеточные организмы, содержащие мутантный ген, при условии, что мутация не вызывает летального исхода. У некоторых из этих животных измененный ген будет включен в зародышевые клетки — мутация зародышевой линии — позволяя передать мутантный ген их потомству.

Генетические преобразования такого рода в настоящее время обычно проводятся с такими сложными организмами, как дрозофилы и млекопитающие.Технически теперь даже люди могут быть преобразованы таким образом, хотя такие процедуры не проводятся даже в терапевтических целях из-за страха перед непредсказуемыми отклонениями, которые могут возникнуть у таких людей.

Ранее в этой главе мы обсуждали другие подходы к обнаружению функции гена, включая поиск гомологичных генов в других организмах и определение того, когда и где ген экспрессируется. Этот тип информации особенно полезен для подсказок, какие фенотипы искать у мутантных организмов.Например, ген, который экспрессируется только в печени взрослого человека, может играть роль в разложении токсинов, но вряд ли повлияет на развитие глаза. Все эти подходы могут использоваться либо для изучения отдельных генов, либо для попытки крупномасштабного анализа функции каждого гена в организме — развивающаяся область, известная как функциональная геномика .

Клетки и животные, содержащие мутировавшие гены, могут быть изготовлены по заказу

Мы видели, что поиск гомологичных генов и анализ паттернов экспрессии генов могут дать ключ к разгадке функции генов, но они не раскрывают, что именно ген делает внутри клетки.Генетика обеспечивает мощное решение этой проблемы, потому что мутанты, у которых отсутствует конкретный ген, могут быстро выявить функцию белка, который он кодирует. Как мы увидим, методы генной инженерии позволяют специально производить такие нокауты генов. Однако можно также создать мутанты, которые экспрессируют ген на аномально высоких уровнях (сверхэкспрессия), в неправильной ткани или в неправильное время (неправильная экспрессия) или в слегка измененной форме, которая проявляет доминантный фенотип. Чтобы облегчить такие исследования функции гена, можно сконструировать кодирующую последовательность гена и его регуляторные области, чтобы изменить функциональные свойства белкового продукта, количество продуцируемого белка или конкретный тип клеток, в которых продуцируется этот белок.

Измененные гены вводятся в клетки различными способами, некоторые из которых подробно описаны в главе 9. ДНК можно микроинъектировать в клетки млекопитающих с помощью стеклянной микропипетки или вводить вирусом, который был сконструирован для переноса чужеродных генов. В клетки растений гены часто вводятся методом, называемым бомбардировкой частицами: образцы ДНК наносятся на крошечные золотые бусинки, а затем буквально выстреливаются через клеточную стенку из специально модифицированного пистолета. Электропорация — это предпочтительный метод введения ДНК в бактерии и некоторые другие клетки.В этом методе кратковременный электрический разряд делает клеточную мембрану временно проницаемой, позволяя чужеродной ДНК проникать в цитоплазму.

Теперь мы рассмотрим, как изучение таких мутантных клеток и организмов позволяет расчленять биологические пути.

Нормальный ген в клетке может быть напрямую заменен сконструированным мутантным геном у бактерий и некоторых низших эукариот

В отличие от высших эукариот (которые являются многоклеточными и диплоидными), бактерии, дрожжи и клеточная слизистая плесень обычно существуют. как гаплоидные одиночные клетки.У этих организмов искусственно введенная молекула ДНК, несущая мутантный ген, может с относительно высокой частотой заменять единственную копию нормального гена путем гомологичной рекомбинации (см. С. 276), так что легко получить клетки, в которых мутантный ген ген заменил нормальный ген (). Таким образом, клетки могут быть созданы для того, чтобы производить измененную форму любого конкретного белка или молекулы РНК вместо нормальной формы молекулы. Если мутантный ген полностью неактивен и продукт гена обычно выполняет важную функцию, клетка погибает; но в этом случае менее сильно мутированная версия гена может использоваться для замены нормального гена, так что мутантная клетка выживает, но является аномальной в процессе, для которого требуется ген.Часто выбранным мутантом является тот, который продуцирует чувствительный к температуре генный продукт, который обычно функционирует при одной температуре, но инактивируется, когда клетки переводятся на более высокую или более низкую температуру.

Рисунок 8-64

Замена гена, нокаут гена и добавление гена. Нормальный ген может быть изменен несколькими способами в организме, созданном с помощью генной инженерии. (A) Нормальный ген (зеленый) может быть полностью заменен мутантной копией гена (красный) , этот процесс называется заменой гена.(подробнее …)

Способность выполнять прямые замены генов у низших эукариот в сочетании с возможностями стандартного генетического анализа этих гаплоидных организмов в значительной степени объясняет, почему исследования этих типов клеток так важны для разработки. детали тех процессов, которые разделяют все эукариоты. Как мы увидим, замены генов возможны, но их труднее выполнить у высших эукариот по причинам, которые не совсем понятны.

Сконструированные гены могут быть использованы для создания специфических доминантных отрицательных мутаций у диплоидных организмов

Высшие эукариоты, такие как млекопитающие, плодовые мухи или черви, являются диплоидными и поэтому имеют по две копии каждой хромосомы.Более того, трансфекция измененным геном обычно приводит к добавлению гена, а не замене гена: измененный ген вставляется в случайное место в геноме, так что клетка (или организм) в конечном итоге получает мутировавший ген в дополнение к его нормальному гену. копии.

Поскольку в высших эукариотических клетках добавление гена намного проще, чем его замену, полезно создавать специфические доминантно-негативные мутации, при которых мутантный ген устраняет активность своих нормальных аналогов в клетке.Один оригинальный подход использует специфичность реакций гибридизации между двумя комплементарными цепями нуклеиновых кислот. Обычно только одна из двух цепей ДНК в данном участке двойной спирали транскрибируется в РНК, и это всегда одна и та же цепь для данного гена (см.). Если клонированный ген сконструирован так, что вместо этого транскрибируется противоположная цепь ДНК, он будет производить антисмысловые молекулы РНК, последовательность которых комплементарна нормальным транскриптам РНК. Такая антисмысловая РНК при синтезе в достаточно больших количествах часто может гибридизоваться с «смысловой» РНК, созданной нормальными генами, и тем самым ингибировать синтез соответствующего белка ().Родственный метод включает химический или ферментативный синтез коротких антисмысловых молекул нуклеиновых кислот с последующей инъекцией (или другой доставкой) их в клетки, снова блокируя (хотя и временно) выработку соответствующего белка. Чтобы избежать деградации введенной нуклеиновой кислоты, вместо обычной РНК часто используют стабильный синтетический аналог РНК, называемый морфолино-РНК.

Рисунок 8-65

Стратегия антисмысловой РНК для генерации доминантно-негативных мутаций.Мутантные гены, которые были сконструированы для производства антисмысловой РНК, которая комплементарна по последовательности РНК, образованной нормальным геном X, могут вызывать образование двунитевой РНК внутри (подробнее …) Стратегия РНК, они сделали интересное открытие. Антисмысловая цепь РНК может блокировать экспрессию гена, но препарат двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащий как смысловую, так и антисмысловую цепи гена-мишени, подавляет активность генов-мишеней еще более эффективно (см.).Этот феномен, получивший название РНК-интерференция (РНКи), теперь используется для изучения функции генов у нескольких организмов.

Метод РНКи широко используется для изучения функции генов нематоды C. elegans . При работе с червями введение дцРНК довольно просто: РНК можно вводить непосредственно в кишечник животного, или червя можно кормить с помощью E. coli , экспрессирующей целевой ген дцРНК (). РНК распределена по всему телу червя и, как было обнаружено, ингибирует экспрессию целевого гена в различных типах тканей.Кроме того, как объяснено в, интерференция часто наследуется потомством инъецированного животного. Поскольку весь геном C. elegans был секвенирован, РНКи используется для помощи в назначении функций для всего набора генов червей. В одном исследовании исследователи смогли подавить 96% из примерно 2300 предсказанных генов на хромосоме III C. elegans . Таким образом, они идентифицировали 133 гена, участвующих в делении клеток у эмбрионов C. elegans ().Из них только 11 ранее приписывались функциям путем прямых экспериментов.

Рис. 8-66

Доминантные отрицательные мутации, вызванные интерференцией РНК. (A) Двухцепочечная РНК (дцРНК) может быть введена в C. elegans (1) путем кормления червей E. coli , экспрессирующей дцРНК, или (2) путем инъекции дцРНК непосредственно в кишечник. (B) Эмбрион червя дикого типа. (подробнее …)

По неизвестным причинам вмешательство РНК не приводит к эффективной инактивации всех генов.Иногда вмешательство может подавить активность целевого гена в одной ткани, а не в другой. Альтернативный способ получения доминантно-отрицательной мутации основан на том факте, что большинство белков функционируют как часть более крупного белкового комплекса. Такие комплексы часто можно инактивировать путем включения только одного нефункционального компонента. Следовательно, создав ген, который продуцирует большие количества мутантного белка, который неактивен, но все еще может собираться в комплекс, часто можно получить клетку, в которой все комплексы инактивированы, несмотря на присутствие нормального белка () .

Рисунок 8-67

Доминирующий отрицательный эффект белка. Здесь создается ген для производства мутантного белка, который не позволяет нормальным копиям того же белка выполнять свою функцию. В этом простом примере нормальный белок должен образовывать комплекс из нескольких субъединиц (подробнее …)

Если белок требуется для выживания клетки (или организма), доминантно-отрицательный мутант умирает, что делает невозможным тестирование функция белка. Чтобы избежать этой проблемы, можно связать мутантный ген с контрольными последовательностями, которые были сконструированы для получения продукта гена только по команде — например, в ответ на повышение температуры или присутствие определенной сигнальной молекулы.Клетки или организмы, содержащие такой доминантный мутантный ген под контролем индуцибельного промотора , могут быть лишены определенного белка в определенное время, и затем можно проследить эффект. Индуцибельные промоторы также позволяют включать и выключать гены в определенных тканях, что позволяет исследовать действие мутантного гена в выбранных частях организма. В будущем методы получения доминантно-негативных мутаций для инактивации определенных генов, вероятно, будут широко использоваться для определения функций белков у высших организмов.

Мутации с усилением функции дают ключ к разгадке роли генов в клетке или организме

Точно так же, как клетки могут быть сконструированы для экспрессии доминантно-отрицательной версии белка, что приводит к фенотипу потери функции , они также могут быть сконструированы для отображения нового фенотипа посредством мутации с усилением функции . Такие мутации могут придавать новую активность конкретному белку или они могут вызывать экспрессию белка с нормальной активностью в неподходящее время или в неправильной ткани животного.Независимо от механизма, мутации с усилением функции могут вызывать новый фенотип в клетке, ткани или организме.

Часто мутанты с повышенной функцией генерируются путем экспрессии гена в клетках на гораздо более высоком уровне, чем обычно. Такая сверхэкспрессия может быть достигнута путем связывания гена с мощной последовательностью промотора и помещения его в многокопийную плазмиду или интеграции его в нескольких копиях в геном. В любом случае ген присутствует во многих копиях, и каждая копия управляет транскрипцией необычно большого количества молекул мРНК.Хотя эффект, который такая сверхэкспрессия оказывает на фенотип организма, следует интерпретировать с осторожностью, этот подход предоставил неоценимую информацию об активности многих генов. При альтернативном типе мутации с усилением функции мутантный белок производится в нормальных количествах, но гораздо более активен, чем его нормальный аналог. Такие белки часто обнаруживаются в опухолях, и их использовали для изучения путей передачи сигналов в клетках (обсуждаемых в главе 15).

Гены также могут экспрессироваться в неправильное время или в неправильном месте в организме — часто с поразительными результатами ().Такая неправильная экспрессия чаще всего достигается путем реинжиниринга самих генов, тем самым снабжая их регуляторными последовательностями, необходимыми для изменения их экспрессии.

Рисунок 8-68

Эктопическая неправильная экспрессия Wnt, сигнального белка, который влияет на развитие оси тела у ранних эмбрионов Xenopus . В этом эксперименте мРНК, кодирующая Wnt, была введена в вентральный вегетативный бластомер, индуцируя вторую ось тела (обсуждается в (подробнее …)

Гены

могут быть переработаны для продукции белков любой желаемой последовательности

При изучении действия ген и белок, который он кодирует, не всегда хочется вносить радикальные изменения — наводнять клетки огромным количеством гиперактивного белка или полностью удалять генный продукт.Иногда полезно внести небольшие изменения в структуру белка, чтобы можно было начать анализировать, какие части белка важны для его функции. Например, активность фермента можно изучить, изменив одну аминокислоту в его активном сайте. Для такого тонкого изменения генов и их белковых продуктов требуются специальные методы. Первым шагом часто является химический синтез короткой молекулы ДНК, содержащей желаемую измененную часть нуклеотидной последовательности гена.Этот синтетический ДНК-олигонуклеотид гибридизируется с одноцепочечной плазмидной ДНК, которая содержит изменяемую последовательность ДНК, с использованием условий, позволяющих спариваться несовершенным цепям ДНК (). Синтетический олигонуклеотид теперь будет служить праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой, тем самым создавая двойную спираль ДНК, которая включает измененную последовательность в одну из своих двух цепей. После трансфекции получают плазмиды, несущие полностью модифицированную последовательность гена. Соответствующая ДНК затем вставляется в вектор экспрессии, чтобы модифицированный белок мог быть произведен в подходящем типе клеток для детального изучения его функции.Изменяя таким образом выбранные аминокислоты в белке — метод, называемый сайт-направленным мутагенезом — можно точно определить, какие части полипептидной цепи важны для таких процессов, как сворачивание белка, взаимодействия с другими белками и ферментативный катализ.

Фигура 8-69

Использование синтетического олигонуклеотида для модификации кодирующей белок области гена путем сайт-направленного мутагенеза. (A) Рекомбинантная плазмида, содержащая вставку гена, разделяется на две цепи ДНК.Соответствующий синтетический олигонуклеотидный праймер (подробнее …)

Сконструированные гены могут быть легко вставлены в зародышевую линию многих животных

При конструировании организма, который должен экспрессировать измененный ген, в идеале хотелось бы иметь возможность заменить нормальный ген с измененным, так что функция мутантного белка может быть проанализирована в отсутствие нормального белка. Как обсуждалось выше, этого легко добиться у некоторых гаплоидных одноклеточных организмов. В следующем разделе мы увидим, что были разработаны гораздо более сложные процедуры, позволяющие заменять гены этого типа у мышей.Однако чужеродная ДНК может быть довольно легко интегрирована в случайные позиции геномов многих животных. У млекопитающих, например, линейные фрагменты ДНК, введенные в клетки, быстро лигируются от конца к концу внутриклеточными ферментами с образованием длинных тандемных массивов, которые обычно интегрируются в хромосому в явно случайном месте. В этом отношении оплодотворенные яйца млекопитающих ведут себя так же, как и другие клетки млекопитающих. Яйцо мыши, в которое вводят 200 копий линейной молекулы ДНК, часто превращается в мышь, содержащую во многих своих клетках тандемный массив копий введенного гена, интегрированный в одном случайном месте в одной из ее хромосом.Если модифицированная хромосома присутствует в клетках зародышевой линии (яйцеклетки или сперматозоиды), мышь передаст эти чужеродные гены своему потомству.

Животные, которые были постоянно модернизированы путем вставки, делеции или замены гена, называются трансгенными организмами, а любые добавленные чужеродные или модифицированные гены называются трансгенами . Когда нормальный ген остается, в фенотипическом анализе будут обнаружены только доминантные эффекты изменения. Тем не менее трансгенные животные со встроенными генами предоставили важную информацию о том, как гены млекопитающих регулируются и как определенные измененные гены (называемые онкогенами) вызывают рак.

Также возможно получить трансгенных плодовых мушек, у которых отдельные копии гена случайным образом вставляются в геном Drosophila . В этом случае фрагмент ДНК сначала вставляется между двумя концевыми последовательностями транспозона Drosophila , называемого P-элементом. Концевые последовательности позволяют элементу P интегрироваться в хромосомы Drosophila , когда также присутствует фермент транспозаза P элемента (см. Стр. 288). Поэтому для получения трансгенных плодовых мушек соответствующим образом модифицированный фрагмент ДНК вводят в очень молодой зародыш плодовой мушки вместе с отдельной плазмидой, содержащей ген, кодирующий транспозазу.Когда это делается, введенный ген часто попадает в зародышевую линию в единственной копии в результате события транспозиции.

Нацеливание на гены делает возможным получение трансгенных мышей, у которых отсутствуют определенные гены

Если молекула ДНК, несущая мутировавший ген мыши, переносится в клетку мыши, она обычно вставляется в хромосомы случайным образом, но примерно один раз из тысячи. , он заменяет одну из двух копий нормального гена путем гомологичной рекомбинации. Используя эти редкие события «нацеливания на ген», любой конкретный ген может быть изменен или инактивирован в клетке мыши путем прямой замены гена.В особом случае, когда интересующий ген инактивирован, полученное животное называется «нокаутной» мышью.

Методика работает следующим образом: на первом этапе фрагмент ДНК, содержащий желаемый мутантный ген (или фрагмент ДНК, предназначенный для прерывания целевого гена), вставляется в вектор, а затем вводится в специальную линию мыши, полученной из эмбриона. стволовые клетки, называемые эмбриональными стволовыми клетками или ES-клетками, которые растут в культуре клеток и способны продуцировать клетки многих различных типов тканей.После периода клеточной пролиферации выделяются редкие колонии клеток, в которых событие гомологичной рекомбинации, вероятно, вызвало замену гена. Правильные колонии среди них идентифицируются с помощью ПЦР или саузерн-блоттинга: они содержат последовательности рекомбинантной ДНК, в которых вставленный фрагмент полностью или частично заменяет одну копию нормального гена. На втором этапе отдельные клетки из идентифицированной колонии переносятся в тонкую микропипетку и вводятся раннему эмбриону мыши.Трансфицированные стволовые клетки, полученные из эмбриона, взаимодействуют с клетками эмбриона-хозяина, чтобы получить нормальную мышь; большие части этого химерного животного, включая — в благоприятных случаях — клетки зародышевой линии, часто происходят из искусственно измененных стволовых клеток ().

Рисунок 8-70

Краткое описание процедур, используемых для замены генов у мышей. На первом этапе (A) измененная версия гена вводится в культивируемые ES (эмбриональные стволовые) клетки. Только у нескольких редких ES-клеток будут заменены соответствующие нормальные гены (больше…)

Мышей с трансгеном в их зародышевой линии разводят с получением как самцов, так и самок животных, каждое из которых гетерозиготно по замене гена (то есть у них есть одна нормальная и одна мутантная копии гена). Когда эти две мыши по очереди спариваются, четверть их потомства будет гомозиготной по измененному гену. Исследования этих гомозигот позволяют исследовать функцию измененного гена или эффекты устранения активности гена в отсутствие соответствующего нормального гена.

Возможность готовить трансгенных мышей, лишенных известного нормального гена, стала большим достижением, и в настоящее время этот метод используется для анализа функций большого количества генов млекопитающих (). Связанные методы могут быть использованы для получения условных мутантов, в которых выбранный ген нарушается в конкретной ткани в определенный момент развития. Стратегия использует преимущества системы сайт-специфической рекомбинации для вырезания — и, таким образом, отключения — целевого гена в определенном месте или в определенное время.Наиболее распространенная из этих систем рекомбинации, называемая Cre / lox , широко используется для создания замен генов у мышей и растений (см.). В этом случае целевой ген в ES-клетках заменяется полностью функциональной версией гена, фланкированной парой коротких последовательностей ДНК, называемых lox-сайтами, которые распознаются рекомбиназным белком Cre. Полученные трансгенные мыши фенотипически нормальны. Затем их скрещивают с трансгенными мышами, которые экспрессируют ген рекомбиназы Cre под контролем индуцибельного промотора.В конкретных клетках или тканях, в которых включен Cre, он катализирует рекомбинацию между последовательностями lox — вырезая целевой ген и устраняя его активность. Подобные системы рекомбинации используются для создания условных мутантов у Drosophila (см.).

Рисунок 8-71

Мышь с сконструированным дефектом фактора роста фибробластов 5 (FGF5). FGF5 — негативный регулятор образования волос. У мыши, лишенной FGF5 (справа) , шерсть длиннее по сравнению с ее гетерозиготным однопометником (слева) .Трансгенные мыши с фенотипами, которые (подробнее …)

Трансгенные растения важны как для клеточной биологии, так и для сельского хозяйства

Когда растение повреждено, оно часто может восстанавливать себя посредством процесса, в котором зрелые дифференцированные клетки «дедифференцируются», размножаются, а затем повторно дифференцироваться в другие типы клеток. В некоторых случаях дедифференцированные клетки могут даже образовывать апикальную меристему, которая затем может дать начало целому новому растению, включая гаметы. Эту замечательную пластичность растительных клеток можно использовать для создания трансгенных растений из клеток, растущих в культуре.

Когда часть растительной ткани культивируется в стерильной среде, содержащей питательные вещества и соответствующие регуляторы роста, многие клетки стимулируются к неограниченной беспорядочной пролиферации, образуя массу относительно недифференцированных клеток, называемую каллусом. Если с питательными веществами и регуляторами роста тщательно манипулировать, можно вызвать образование побега, а затем и апикальных меристем корня внутри каллуса, и у многих видов можно регенерировать совершенно новое растение.

Каллусные культуры также могут быть механически диссоциированы на отдельные клетки, которые будут расти и делиться как суспензионная культура. На некоторых растениях, включая табак, петунию, морковь, картофель и Arabidopsis , из одной суспензии культуры можно вырастить небольшую глыбу (клон), из которой можно регенерировать целое растение. Такая клетка, которая способна давать начало всем частям организма, считается тотипотентной . Подобно тому, как мутантные мыши могут быть получены путем генетических манипуляций с эмбриональными стволовыми клетками в культуре, трансгенные растения могут быть созданы из отдельных тотипотентных растительных клеток, трансфицированных ДНК в культуре ().

Рис. 8-72

Процедура, используемая для создания трансгенного растения. (A) Краткое описание процесса. Диск вырезают из листа и инкубируют в культуре с Agrobacteria , которые несут рекомбинантную плазмиду как с селективным маркером, так и с желаемым трансгеном. Раненые клетки в (подробнее …)

Возможность производить трансгенные растения значительно ускорила прогресс во многих областях биологии растительных клеток. Он сыграл важную роль, например, в выделении рецепторов для регуляторов роста и в анализе механизмов морфогенеза и экспрессии генов в растениях.Это также открыло много новых возможностей в сельском хозяйстве, которые могут принести пользу как фермерам, так и потребителям. Это позволило, например, изменить запасы липидов, крахмала и белка, сохраняемые в семенах, придать растениям устойчивость к вредителям и вирусам, а также создать модифицированные растения, которые выдерживают экстремальные условия обитания, такие как солончаки или почва с дефицитом воды. .

Многие из основных достижений в понимании развития животных были достигнуты благодаря исследованиям плодовой мухи Drosophila и нематодного червя Caenorhabditis elegans , которые поддаются обширному генетическому анализу, а также экспериментальным манипуляциям.По сравнению с этим прогресс в биологии развития растений в прошлом был относительно медленным. Многие растения, которые оказались наиболее поддающимися генетическому анализу, такие как кукуруза и томат, имеют длительные жизненные циклы и очень большие геномы, что делает как классический, так и молекулярно-генетический анализ трудоемким. Вследствие этого все большее внимание уделяется быстрорастущему мелкому сорняку, кресс-салату обыкновенному (Arabidopsis thaliana), , который имеет несколько основных преимуществ в качестве «модельного растения» (см. И).Относительно небольшой геном Arabidopsis был первым геномом растения, который был полностью секвенирован.

Большие коллекции помеченных нокаутов предоставляют инструмент для изучения функции каждого гена в организме

В настоящее время ведутся обширные совместные усилия по созданию всеобъемлющих библиотек мутаций в нескольких модельных организмах, включая S. cerevisiae, C. elegans , Drosophila , Arabidopsis и мышь. Конечная цель в каждом случае — создать коллекцию мутантных штаммов, в которых каждый ген в организме был либо систематически удален, либо изменен таким образом, чтобы его можно было условно нарушить.Коллекции этого типа станут бесценным инструментом для исследования функции генов в геномном масштабе. В некоторых случаях каждый из отдельных мутантов в коллекции будет иметь особую молекулярную метку — уникальную последовательность ДНК, предназначенную для быстрой и рутинной идентификации измененного гена.

В S. cerevisiae задача создания набора из 6000 мутантов, в каждом из которых отсутствует только один ген, упрощается из-за склонности дрожжей к гомологичной рекомбинации. Для каждого гена готовят «кассету делеции».Кассета состоит из специальной молекулы ДНК, содержащей 50 нуклеотидов, идентичных по последовательности каждому концу целевого гена, окружающих селектируемый маркер. Кроме того, в эту молекулу ДНК встроена специальная последовательность «штрих-код» для облегчения последующей быстрой идентификации каждого результирующего мутантного штамма (). Затем можно выращивать большую смесь таких мутантов с нокаутом гена в различных условиях селективного тестирования, таких как отсутствие питания, температурный сдвиг или присутствие различных лекарств, и выжившие клетки можно быстро идентифицировать по их уникальным тегам последовательности.Оценив, насколько хорошо себя чувствует каждый мутант в смеси, можно начать оценивать, какие гены являются важными, полезными или нерелевантными для роста в различных условиях.

Рисунок 8-73

Создание коллекций мутантных организмов. (A) Кассета делеции для использования в дрожжах содержит последовательности, гомологичные каждому концу целевого гена x (красный), , селектируемый маркер (синий), и уникальную последовательность «штрих-кода», приблизительно 20 нуклеотидов (больше. ..)

Проблема получения информации из исследования таких мутантов дрожжей заключается в определении активности или биологической роли гена на основе мутантного фенотипа.Некоторые дефекты — например, неспособность жить без гистидина — прямо указывают на функцию гена дикого типа. Другие связи могут быть не такими очевидными. Что может означать внезапная чувствительность к холоду о роли, которую играет конкретный ген в дрожжевой клетке? Таких проблем еще больше у организмов более сложных, чем дрожжи. Утрата функции одного гена у мышей, например, может повлиять на множество различных типов тканей на разных стадиях развития, тогда как потеря других генов не имеет очевидного эффекта.Адекватная характеристика мутантных фенотипов у мышей часто требует тщательного обследования, наряду с обширными знаниями анатомии, гистологии, патологии, физиологии и сложного поведения мышей.

Однако понимание, полученное при изучении мутантных библиотек, будет отличным. Например, исследования обширной коллекции мутантов Mycoplasma genitalium — организма с наименьшим известным геномом — выявили минимальный набор генов, необходимых для клеточной жизни.Анализ пула мутантов предполагает, что 265–350 из 480 кодирующих белок генов в M. genitalium необходимы для роста в лабораторных условиях. Приблизительно 100 из этих важных генов имеют неизвестную функцию, что говорит о том, что удивительное количество основных молекулярных механизмов, лежащих в основе клеточной жизни, еще предстоит открыть.

Резюме

Генетика и генная инженерия предоставляют мощные инструменты для изучения функций генов как в клетках, так и в организмах.В классическом генетическом подходе случайный мутагенез сочетается со скринингом для выявления мутантов, дефицитных в конкретном биологическом процессе. Затем эти мутанты используются для поиска и изучения генов, ответственных за этот процесс.

Функция гена также может быть определена с помощью обратных генетических методов. Методы ДНК-инженерии можно использовать для мутации любого гена и повторной вставки его в хромосомы клетки, чтобы он стал постоянной частью генома. Если клетка, используемая для этого переноса гена, представляет собой оплодотворенное яйцо (для животного) или тотипотентную растительную клетку в культуре, могут быть получены трансгенные организмы, которые экспрессируют мутантный ген и передают его своему потомству.Особенно важна для клеточной биологии способность изменять клетки и организмы весьма специфическим образом, позволяя различить влияние на клетку или организм запланированного изменения одного белка или молекулы РНК.

Многие из этих методов расширяются для исследования функции генов в масштабе всего генома. Такие технологии, как ДНК-микрочипы, можно использовать для одновременного мониторинга экспрессии тысяч генов, обеспечивая подробные, исчерпывающие снимки динамических паттернов экспрессии генов, лежащих в основе сложных клеточных процессов.А создание мутантных библиотек, в которых каждый ген в организме был систематически удален или поврежден, станет неоценимым инструментом для изучения роли каждого гена в сложной молекулярной кооперации, которая дает начало жизни.

Система экспрессии генов

— обзор

Система экспрессии: клетки HEK 293T

KOD-плюс-полимераза (TOYOBO)

Вектор экспрессии pFLAG-CMV ™ -3 (Sigma-Aldrich)

03 904 Реагент LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen)

ANTI-FLAG ^® Агарозный аффинный гель M2 (Sigma-Aldrich)

FLAG ^® меченая бактериальная щелочная фосфатаза Sigma Sigma

50 мл M Трис-буферный физиологический раствор (TBS): 50 мл M Трис-HCl (pH 7.4) и 150 мкл M NaCl, приготовленный в воде Milli-Q

Сахарный нуклеотид (CMP-Neu5Ac, UDP-GlcNAc, GDP-Fuc, UDP-Gal и UDP-GalNAc; Sigma-Aldrich) получают в подходящей концентрации в воде Milli-Q и хранении в замороженном состоянии

Основная реакционная смесь: 25 м M HEPES-буфер (pH 7,0) и 10 м M MnCl ₂

Обратно-фазовая колонка для ВЭЖХ: колонка PALPAK Type R (4,6 × 250 мм, 5 мкм; Takara Bio)

Растворитель A: 10 м M ацетат аммония (pH 4.0) в воде Milli-Q

Растворитель B: 10 м M ацетат аммония (pH 4,0) в 10% ацетонитриле (об. / Об.)

Пептид тандемных повторов Muc1a, меченный карбоксифлуоресцеином (FAM) (FAM -AHGVTSAPDTR) получают путем индивидуального пептидного синтеза

Калибровочный раствор: калибровочный стандарт пептида II (Bruker Daltonics) в 200 мкл 0,1% TFA в 25% ацетонитриле

Раствор матрицы: 10 мг / мл 2,5 -дигидроксибензойная кислота (2,5-DHB, марка протеомики; Wako) в 30% этаноле

Боргидрид натрия (NaBH ₄; Wako)

Гранулы гидроксида натрия (NaOH; Wako)

кислота (класс ЖХ / МС; Wako)

Трифторуксусная кислота (степень чистоты для ВЭЖХ; Wako)

Ацетат лития (Wako)

Йодометан (MeI; Wako)

∞ Dimethyl sulx2 Чистый; Вако)

Картридж для обращенно-фазовой твердофазной экстракции (SPE): ZipTip C18 (Millipore), Sep-Pak C18 (50 мг / 1 мл; Waters) и Oasis HLB (10 мг / 1 мл; Waters)

Катионообменный картридж SPE: Oasis MCX (30 мг / 1 мл; Waters)

Пористый графитированный уголь (PGC; Alltech Associates)

Основная установка для экспрессии и очистки белков — Экспрессия белков — E.coli

Общая стратегия

Чтобы ускорить производство белка, мы приняли стратегию параллельной экспрессии белка из множества векторов, содержащих разные теги и / или партнеров по слиянию, и из множества штаммов-хозяев E. coli. Такой подход должен не только сэкономить нам много времени, но и привести к большему количеству успешно экспрессируемых белков.

Стратегия экспрессии состоит из следующих двух наборов экспериментов:

1.Экспрессия белка в основном штамме-хозяине E. coli из различных векторов с разными тегами и / или партнерами по слиянию.

Наш первый скрининг предназначен для экспрессии белка в BL21 (DE3) из модифицированных pET-векторов со следующим набором тегов и партнеров слияния:

Тег	партнер по слиянию
N-концевой His ₆-тег
N-концевой His ₆-тег	тиоредоксин
N-концевой His ₆-тег	глутатион-S-трансфераза ( GST )
N-концевой His ₆-тег	мальтозосвязывающий белок ( MBP )
N-концевой His ₆-тег	дисульфид оксидоредуктаза ( DsbA )
N-концевой His ₆-тег	NusA
C-терминал His ₆-тег

2.Экспрессия белка из стандартного вектора в ряде различных штаммов-хозяев E. coli .

Выбор штаммов-хозяев больше зависит от природы гетерологичного белка. Следует учитывать следующие факторы:

Если белок содержит большое количество редких кодонов E. coli , стоит попытаться экспрессировать его в штамме, коэкспрессирующем тРНК для этих редких кодонов. В продаже имеется несколько штаммов:

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL	AGG / AGA (аргинин), AUA (изолейцин) и CUA (лейцин)	Stratagene
BL21 (DE3) CodonPlus-RP	AGG / AGA (аргинин) и CCC (пролин)	Stratagene
Rosetta or Rosetta (DE3)	AGG / AGA (аргинин), CGG (аргинин), AUA (изолейцин) CUA (лейцин) CCC (пролин) и GGA (глицин)	Новаген

Если белок содержит одну или несколько дисульфидных связей , правильная укладка стимулируется в штамме хозяина с более окислительной цитоплазматической средой.Два штамма коммерчески доступны от Novagen:

AD494	мутация тиоредоксинредуктазы (trxB)
Оригами	двойной мутант по тиоредоксинредуктазе (trxB) и глутатионредуктазе (gor)

Если белок токсичен для клетки , экспрессия в штамме, содержащем вектор pLysS или pLysE , ужесточает регуляцию систем экспрессии с использованием промотора T7 .Эти векторы экспрессируют лизоцим, который связывается с РНК-полимеразой Т7 и инактивирует ее. Штаммы коммерчески доступны от разных производителей.
Если белок мембраносвязанный , экспрессия в мутантных штаммах C41 (DE3) и C43 (DE3) может улучшить уровни экспрессии.
Ссылка: Miroux, B. & Walker, J.E. (1996) J. Mol. Биол. 260, 289-298.

Наш первый скрининг предназначен для экспрессии белка из модифицированного pET-вектора с N-концевым His ₆-тегом в следующих штаммах-хозяевах:

Штамм хозяина

BL21 (DE3)

BL21 (DE3) pLysS

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (-RP) или Rosetta (DE3)

Оригами (DE3)

Для быстрого скрининга уровней экспрессии и растворимости белков в разных векторах и в разных штаммах мы разработали маломасштабный метод с использованием хроматографии на магнитных шариках.

Результаты первого экрана будут отправной точкой для дальнейших экспериментов в случае, если не были найдены удовлетворительные условия выражения. Как оптимизировать уровни экспрессии, улучшить растворимость белка, повысить стабильность белка и снизить токсичность белка, будет обсуждаться в других главах этого веб-сайта.

Метод выражения

Типичный эксперимент с выражением состоит из следующего шага:

Отбор единственной колонии из чашки со свежими штрихами экспрессионного хозяина, содержащего рекомбинантный вектор.Когда гетерологичный белок токсичен для клеток, более высокие уровни экспрессии достигаются с помощью так называемого метода «посева».
Выращивание закваски . Засейте отобранной колонией до 50 мл богатой среды (например, LB или 2xYT ), содержащей соответствующий антибиотик. Если требуется более крупная заквасочная культура, засевайте 4 мл богатой среды единственной колонией; выращивать 4-8 часов при 37 ° C; и используйте это для инокуляции закваски.

Не позволяйте культурам расти при 37 ° C в течение ночи! Ночные культуры лучше выращивать при 30 ° C или ниже. В качестве альтернативы культуру можно инкубировать при 37 ° C до тех пор, пока OD ₆₀₀ не составит прибл. 1. Затем храните культуру при 4 ° C в течение ночи. На следующее утро соберите клетки центрифугированием, ресуспендируйте их в свежей среде и используйте ее для инокуляции основной культуры.

Использование ампициллина требует особой осторожности. Селективный маркер, β-лактамаза, секретируется в среду, где гидролизует весь ампициллин.Этот момент наступает уже тогда, когда культура еле мутная. С этого момента клетки, в которых отсутствует плазмида, не будут убиты и могут разрастаться в культуре (что можно проверить с помощью теста стабильности плазмиды). Некоторые возможные решения:

выращивают ночные культуры при 30 ° C или ниже.
центрифугировать ночные культуры и ресуспендировать осадок в свежей среде для удаления β-лактамазы.
использует более стабильный карбенициллин вместо ампициллина.
Инокуляция основной культуры и инкубация до тех пор, пока OD ₆₀₀ не достигнет 0,4-1. Оптимальное значение OD зависит от метода культивирования и среды. Для культур в колбах с использованием среды LB рекомендуется OD ₆₀₀ из 0,6 . Чтобы увеличить скорость роста, мы проводим культивирование при 37 ° C до достижения OD для индукции. Затем культуры охлаждают до температуры индукции в ледяной воде.

Примечание. Для хорошей аэрации не используйте больше среды, чем 20% от общего объема колбы.

Индукция экспрессии белка. Экспрессия белка индуцируется добавлением подходящего индуктора или изменением условий роста. С этого момента клетки будут использовать большую часть своих ресурсов для производства целевого белка и не будут расти дальше.

Условия индукции наиболее часто используемых промоторов приведены ниже.

Промоутер	индукционный	типичное состояние	диапазон
trc (гибрид)	добавление IPTG	0.2 мМ	0,05 — 2,0 мМ
araBAD	прибавление l-арабинозы	0,2%	0,002 — 0,4%
пол. _л.	смещение температуры	от 37 до 42 ° C
T7- lac оператор	добавление IPTG	0,2 мМ	0.05 -2,0 мМ

После индукции культуры инкубируют от 3 часов до ночи в зависимости от температуры индукции. Ориентиры приведены ниже.

Температура инкубации	время инкубации
15 ° С	ночь
20 ° С	ночь
25 ° С	ночь
30 ° С	5-6 ч
37 ° С	3-4 ч

Сбор осадка клеток центрифугированием (20 мин при 6000 g).Осадки клеток хранят при -20 ° C.

Обзор систем экспрессии белков | Thermo Fisher Scientific

Экспрессия белка относится к способу, которым белки синтезируются, модифицируются и регулируются в живых организмах. В исследованиях белков этот термин может применяться либо к объекту исследования, либо к лабораторным методам, необходимым для производства белков. В этой статье основное внимание уделяется последнему значению выражения белка. Однако с практической точки зрения производство рекомбинантного белка зависит от использования клеточного аппарата.

Просмотр и выбор продуктов

Введение в экспрессию белков

Белки синтезируются и регулируются в зависимости от функциональной потребности клетки. Чертежи белков хранятся в ДНК и расшифровываются строго регулируемыми процессами транскрипции для производства информационной РНК (мРНК). Сообщение, закодированное мРНК, затем транслируется в белок. Транскрипция — это передача информации от ДНК к мРНК, а трансляция — это синтез белка на основе последовательности, указанной мРНК.

Простая схема транскрипции и перевода. Это описывает общий поток информации от последовательности пар оснований ДНК (гена) к последовательности аминокислотного полипептида (белка).

У прокариот процессы транскрипции и трансляции происходят одновременно. Трансляция мРНК начинается еще до полного синтеза зрелого транскрипта мРНК. Эта одновременная транскрипция и трансляция гена называется сопряженной транскрипцией и трансляцией.У эукариот процессы пространственно разделены и происходят последовательно: транскрипция происходит в ядре, а трансляция или синтез белка происходит в цитоплазме.

Сравнение транскрипции и трансляции у прокариот и эукариот.

Справочник по экспрессии белков

Это 118-страничное руководство содержит исчерпывающую информацию об экспрессии белков и поможет вам выбрать правильную систему экспрессии и технологии очистки для вашего конкретного применения и потребностей.Получите советы и рекомендации перед началом эксперимента и найдите ответы на повседневные проблемы, связанные с экспрессией белка.

Справочник по экспрессии белков ›

Транскрипция и перевод

Транскрипция происходит в три этапа как у прокариот, так и у эукариот: инициация, удлинение и завершение. Транскрипция начинается, когда двухцепочечная ДНК разматывается для связывания РНК-полимеразы. Как только транскрипция инициируется, РНК-полимераза высвобождается из ДНК.Транскрипция регулируется на различных уровнях активаторами и репрессорами, а также структурой хроматина у эукариот. У прокариот не требуется специальной модификации мРНК, и трансляция сообщения начинается еще до завершения транскрипции. У эукариот, однако, мРНК подвергается дальнейшему процессингу для удаления интронов (сплайсинга), добавления кэпа на 5´ конце и множественных аденинов на 3´ конце мРНК с образованием полиА-хвоста. Затем модифицированная мРНК экспортируется в цитоплазму, где она транслируется.

Трансляция или синтез белка — это многоступенчатый процесс, для которого требуются макромолекулы, такие как рибосомы, транспортная РНК (тРНК), мРНК и белковые факторы, а также небольшие молекулы, такие как аминокислоты, АТФ, ГТФ и другие кофакторы. Для каждого шага трансляции существуют определенные белковые факторы (см. Таблицу ниже). Общий процесс похож как у прокариот, так и у эукариот, хотя существуют определенные различия.

Во время инициации малая субъединица рибосомы, связанная с инициаторной т-РНК, сканирует мРНК, начиная с 5’-конца, для идентификации и связывания инициирующего кодона (AUG).Большая субъединица рибосомы присоединяется к малой субъединице рибосомы, чтобы генерировать комплекс инициации в кодоне инициации. Белковые факторы, а также последовательности мРНК участвуют в распознавании кодона инициации и формировании комплекса инициации. Во время элонгации тРНК связываются со своими назначенными аминокислотами (так называемая зарядка тРНК) и доставляют их к рибосоме, где они полимеризуются с образованием пептида. Последовательность аминокислот, добавленных к растущему пептиду, зависит от последовательности мРНК транскрипта.Наконец, возникающий полипептид высвобождается на стадии терминации, когда рибосома достигает терминального кодона. В этот момент рибосома высвобождается из мРНК и готова начать следующий раунд трансляции.

Аппарат для синтеза белка

Краткое изложение основных компонентов и характеристик прокариотического и эукариотического трансляционного аппарата.

Компонент	Прокариоты	Эукариоты
Рибосомы 966S и 500003 3 Субъединицы	Матрица или мРНК	После транскрипции не происходит дальнейшей обработки транскрипта мРНК. мРНК является полицистронной и содержит несколько сайтов инициации.	После транскрипции транскрипт мРНК сплайсируется для удаления некодирующих областей (интронов), и кэп-структура (M7метилгуанозин) и полиаденозиновая последовательность добавляются в 5 ‘и 3’ конце сообщения соответственно. Структура Cap и поли A важны для экспорта мРНК в цитоплазму, правильной инициации трансляции и стабильности мРНК среди других функций.МРНК обычно моноцистронная.
Особенности трансляции	Последовательность Шайна-Далгарно присутствует в транскрипте мРНК, а комплементарная последовательность присутствует в рибосомной субъединице. Это облегчает связывание и выравнивание рибосомы на мРНК в сайте инициации трансляции (AUG). Первая аминокислота возникающего полипептида — формилированный метионин.	Инициация трансляции происходит двумя способами: Кэп-зависимая трансляция: структура кэпа и связывающие кэп белки отвечают за правильное связывание рибосомы с мРНК и распознавание правильного инициирующего кодона.Первый кодон AUG на 5’-конце мРНК функционирует как кодон инициации. Иногда последовательность Козака может присутствовать вокруг инициирующего кодона. Cap-независимая трансляция: Связывание рибосомы с мРНК происходит через «внутренний сайт входа в рибосому» (IRES) на мРНК.
Факторы инициации	Известны три фактора инициации, IF1, IF2 и IF3	Более трех факторов инициации, которые регулируются фосфорилированием.Этап инициации — это этап, ограничивающий скорость эукариотической трансляции.
Коэффициенты удлинения	EF-Tu и EF-Ts, EF-G	EF1 (α, β, γ) и EF2
9057 Факторы прерывания или разъединения RF1 и RF-2	eRF-1

Посттрансляционная модификация

После трансляции полипептиды модифицируются различными способами для завершения своей структуры, определения их местоположения или регулирования их активности в клетке.Посттрансляционные модификации (ПТМ) представляют собой различные добавления или изменения химической структуры и являются критическими характеристиками общей биологии клетки.

Типы посттрансляционных модификаций включают:

Сворачивание полипептида в глобулярный белок с помощью белков-шаперонов для достижения самого низкого энергетического состояния
Модификации присутствующих аминокислот, такие как удаление первого остатка метионина
Образование или восстановление дисульфидного мостика
Модификации белков, облегчающие функции связывания:
- Гликозилирование
- Пренилирование белков для локализации на мембране
- Ацетилирование гистонов для модификации взаимодействия ДНК-гистонов
Добавление функциональных групп, регулирующих активность белка:
- Фосфорилирование
- Нитрозилирование
- Связывание GTP

Способы экспрессии рекомбинантных белков

В общем, протеомные исследования включают исследование любого аспекта белка, такого как структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия белков.Чтобы изучить, как определенные белки регулируют биологию, исследователям обычно требуются средства производства (производства) представляющих интерес функциональных белков.

Учитывая размер и сложность белков, химический синтез не является жизнеспособным вариантом для этой цели. Вместо этого живые клетки и их клеточные механизмы обычно используются как фабрики для создания и конструирования белков на основе предоставленных генетических шаблонов.

В отличие от белков, ДНК просто построить синтетически или in vitro с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов рекомбинантной ДНК.Следовательно, ДНК-матрицы конкретных генов с дополнительными репортерными последовательностями или последовательностями аффинных меток или без них могут быть сконструированы в качестве матриц для экспрессии белка. Белки, полученные из таких ДНК-матриц, называются рекомбинантными белками.

Традиционные стратегии экспрессии рекомбинантного белка включают трансфекцию клеток ДНК-вектором, содержащим матрицу, а затем культивирование клеток, чтобы они транскрибировали и транслировали желаемый белок. Обычно затем клетки лизируют, чтобы извлечь экспрессированный белок для последующей очистки.Как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии белка in vivo широко используются. Выбор системы зависит от типа белка, требований к функциональной активности и желаемого выхода. Эти системы экспрессии приведены в таблице ниже и включают млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, водорослей и бесклеточные. Каждая система имеет свои преимущества и проблемы, и выбор правильной системы для конкретного применения важен для успешной экспрессии рекомбинантного белка.В следующей таблице представлен обзор систем экспрессии рекомбинантных белков.

Системы экспрессии рекомбинантных белков.

Экспрессия белков млекопитающих

Экспрессионные системы млекопитающих могут быть использованы для получения белков млекопитающих, которые имеют наиболее естественную структуру и активность благодаря физиологически релевантной среде. Это приводит к высокому уровню посттрансляционной обработки и функциональной активности. Системы экспрессии млекопитающих являются предпочтительной системой для экспрессии белков млекопитающих и могут использоваться для продукции антител, сложных белков и белков для использования в функциональных клеточных анализах.Однако эти преимущества сочетаются с более требовательными условиями выращивания.

Экспрессионные системы млекопитающих могут использоваться для временной продукции белков или через стабильные клеточные линии, где экспрессирующая конструкция интегрируется в геном хозяина. В то время как стабильные клеточные линии можно использовать в нескольких экспериментах, временная продукция может генерировать большое количество белка за одну-две недели. Эти временные высокопроизводительные экспрессионные системы млекопитающих используют суспензионные культуры и могут давать выход в граммах на литр.Кроме того, эти белки имеют больше нативных фолдинговых и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, по сравнению с другими системами экспрессии. В следующем примере для экспрессии рекомбинантных белков использовали 3 различных экспрессионных системы млекопитающих.

Выход рекомбинантного белка. Системы экспрессии Gibco FreeStyle CHO, Expi293 и ExpiCHO использовали для временной экспрессии человеческого IgG, кроличьего IgG и EPO (эритропоэтина) с использованием pcDNA 3.4 вектор экспрессии. Протокол Max Titer использовался для ExpiCHO, и белки собирали на 10–12 день. Для FreeStyleCHO и Expi293 белки собирали на 6 или 7 день. Все белки количественно определяли с помощью ForteBio Octet или ELISA. Использование ExpiCHO приводит к более высоким титрам белка по сравнению с FreeStyle CHO и Expi293.

Посмотрите это видео о том, как производить рекомбинантные белки с помощью системы экспрессии ExpiCHO.

Экспрессия белка насекомых

Клетки насекомых можно использовать для экспрессии белка высокого уровня с модификациями, аналогичными системам млекопитающих.Существует несколько систем, которые можно использовать для получения рекомбинантного бакуловируса, который затем можно использовать для экспрессии представляющего интерес белка в клетках насекомых. Эти системы можно легко масштабировать и адаптировать к суспензионной культуре высокой плотности для крупномасштабной экспрессии белка, который более функционально подобен нативному белку млекопитающих. Хотя выходы могут достигать 500 мг / л, получение рекомбинантного бакуловируса может занимать много времени, а условия культивирования более сложны, чем прокариотические системы.

Сводка протокола системы экспрессии бакуловирусов. Система экспрессии бакуловирусов Invitrogen BaculoDirect использует технологию Invitrogen Gateway для клонирования. После 1-часовой реакции рекомбиназы и трансфекции клеток насекомых продуцируется бакуловирус, содержащий интересующий ген. Затем можно провести быстрый тест на экспрессию, прежде чем увеличивать вирусный запас и увеличивать экспрессию. Использование этой системы позволяет экспрессировать бакуловирус в клетках насекомых.

Экспрессия бактериального белка

Системы экспрессии бактериального белка популярны, потому что бактерии легко культивируются, быстро растут и производят высокие выходы рекомбинантного белка. Однако мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны, потому что клетки не оснащены для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного фолдинга. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые очень трудно восстановить без резких денатурирующих агентов и последующих громоздких процедур рефолдинга белков.В следующем примере систему на основе бактериальных клеток использовали для экспрессии 8 различных рекомбинантных белков.

Экспрессия белка в бактериальных клетках. Клонирование шлюза использовали для клонирования 8 белков человека в вектор Invitrogen Champion pET300 / NT-DEST. BL21 (DE3) E. coli использовали для экспрессии положительных клонов либо в LB + IPTG (1), либо в готовой к использованию среде Invitrogen MagicMedia (2), либо в среде MagicMedia, приготовленной из порошка (3). Образцы лизировали и анализировали на окрашенном красителем кумасси синим красителем Invitrogen NuPAGE 4-12% геле с белком бис-трис.M = стандарт протеина Invitrogen SeeBlue. Использование среды MagicMedia E. coli приводит к более высокому выходу белка для разных образцов.

Внеклеточная экспрессия белка

Внеклеточная экспрессия белка — это синтез белка in vitro и с использованием трансляционно-совместимых экстрактов целых клеток. В принципе, экстракты целых клеток содержат все макромолекулы и компоненты, необходимые для транскрипции, трансляции и даже посттрансляционной модификации.Эти компоненты включают РНК-полимеразу, регуляторные белковые факторы, факторы транскрипции, рибосомы и тРНК. При добавлении кофакторов, нуклеотидов и специфической генной матрицы эти экстракты могут синтезировать интересующие белки за несколько часов.

Несмотря на то, что бесклеточные системы экспрессии белка in vitro или трансляции in vitro (IVT) не являются устойчивыми для крупномасштабного производства, они имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными системами in vivo . Бесклеточная экспрессия позволяет быстро синтезировать рекомбинантные белки без хлопот с культивированием клеток.Бесклеточные системы позволяют маркировать белки модифицированными аминокислотами, а также экспрессировать белки, которые подвергаются быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. Кроме того, бесклеточный метод упрощает одновременную экспрессию множества различных белков (например, тестирование мутаций белка путем экспрессии в небольшом масштабе из множества различных матриц рекомбинантной ДНК). В этом репрезентативном эксперименте использовали систему IVT для экспрессии белка каспазы 3 человека.

Экспрессия каспазы-3 в системе IVT человека. каспаза-3 была экспрессирована с использованием набора Thermo Scientific для одностадийной человеческой высокопроизводительной IVT (Human IVT) и в E. coli (рекомбинантная). Активность каспазы-3 определяли с использованием равных количеств белка. Белок каспазы-3, экспрессируемый с помощью системы IVT, был более активен по сравнению с белком, экспрессируемым в бактериях.

Химический синтез белка

Химический синтез белков может использоваться для приложений, требующих белков, меченных неприродными аминокислотами, белков, меченных в определенных местах, или белков, токсичных для биологических систем экспрессии.Химический синтез дает очень чистый белок, но работает только с небольшими белками и пептидами. При химическом синтезе выход часто бывает довольно низким, а для более длинных полипептидов этот метод непомерно дорог.

Иматака Х., Миками С. (2009) Преимущества систем бесклеточного синтеза белков, полученных из клеток человека. Seikagaku 81 (4): 303–7.
Mikami S et al. (2008) Полученная из клеток человека , связанная in vitro с , система транскрипции / трансляции, оптимизированная для продукции рекомбинантных белков. Protein Expr Purif 62 (2): 190–8.
Кобаяши Т. и др. (2007) Улучшенная бесклеточная система синтеза пикорнавирусов. J Virol методы 142 (1-2): 182–8.
Mikami S et al. (2006) Основанная на гибридоме система трансляции in vitro , которая эффективно синтезирует гликопротеины. J Biotechnol 127 (1): 65–78.
Mikami S et al. (2006) Эффективная бесклеточная система трансляции млекопитающих, дополненная факторами трансляции. Protein Expr Purif 46 (2): 348–57.

15: Положительный и отрицательный контроль экспрессии гена

Опероны

Оперон представляет собой кластер скоординированно регулируемых генов. Он включает структурных генов (обычно кодирующих ферменты), регуляторных генов (кодирующих, например, активаторы или репрессоры) и регуляторных сайтов (таких как промоторы и операторы). Тип контроля определяется реакцией оперона, когда регуляторный белок отсутствует. В случае отрицательного контроля гены оперона экспрессируются, если они не выключены репрессорным белком.Таким образом, оперон будет включаться конститутивно (гены будут экспрессироваться), когда репрессор будет инактивирован. В случае положительного контроля гены экспрессируются только тогда, когда активный белок-регулятор, например активатор, присутствует. Таким образом, оперон будет отключен, когда положительный регуляторный белок отсутствует или инактивирован.

Таблица 4.1.1 . Положительный и отрицательный контроль

Катаболические и биосинтетические опероны

Катаболические пути катализируют распад питательных веществ (субстрат для этого пути) для выработки энергии или, точнее, АТФ, энергетической валюты клетки.В отсутствие субстрата , нет причин для присутствия катаболических ферментов, и кодирующий их оперон репрессирован . В присутствии субстрата , когда необходимы ферменты, оперон индуцируется или депрессируется.

**Таблица 4.1.2.** Сравнение катаболических и биосинтетических оперонов
Оперон кодирует	Отсутствие	Эффект	Наличие	Эффект
катаболические ферменты	подложка	репрессированных	подложка	дерепрессия (индуцированная)
ферменты биосинтеза	товар	индуцированный	товар	репрессированных

Например, lac-оперон кодирует ферменты, необходимые для поглощения (пермеаза лактозы) и начального расщепления лактозы (дисахарид bD-галактозил-1-> 4-D-глюкоза) на галактозу и глюкозу (катализируемый b -галактозидаза).Эти моносахариды расщепляются на лактат (главным образом посредством гликолиза с образованием АТФ) и с лактата на СО2 (через цикл лимонной кислоты), производя НАДН, который входит в цепь переноса электронов для производства большего количества АТФ (окислительное фосфорилирование). Это может дать энергию для жизни бактериальной клетки. Однако исходные ферменты (лактозопермеаза и β-галактозидаза) необходимы только и экспрессируются только в присутствии лактозы и в отсутствие глюкозы. В присутствии субстрата лактозы оперон включается, а при ее отсутствии оперон выключается.

Анаболические или биосинтетические пути используют энергию в форме АТФ и восстанавливающие эквиваленты в форме НАД (Ф) Н для катализирования синтеза клеточных компонентов (продукт ) из более простых материалов, например синтез аминокислот из малых дикарбоновых кислот (компонентов цикла лимонной кислоты). Если в клетке уже содержится много продукта (в присутствии продукта ), ферменты, катализирующие его синтез, не нужны, и кодирующий их оперон репрессируется .В отсутствие продукта , когда клетке нужно производить больше, индуцируется биосинтетический оперон . Например, оперон trp кодирует ферменты, которые катализируют превращение хорисминовой кислоты в триптофан. Когда клеточная концентрация Trp (или Trp-tRNAtrp) высока, оперон не экспрессируется, но когда уровни низкие, оперон экспрессируется.

Индуцибельные опероны в сравнении с подавляемыми

Индуцибельные опероны включаются в ответ на метаболит (небольшая молекула, подвергающаяся метаболизму), который регулирует оперон.Например. lac-оперон индуцируется в присутствии лактозы (под действием побочного продукта метаболизма аллолактозы). Репрессируемые опероны отключаются в ответ на небольшую регуляторную молекулу. Например, оперон trp репрессируется в присутствии триптофана. Обратите внимание, что в этом случае термины определяются ответом на небольшую молекулу. Хотя lac является индуцибельным опероном, мы увидим условия, при которых он репрессируется или индуцируется (посредством дерепрессии).

Таблица 4.1.3.

Карта оперона E. colilac

Рисунок 4.1.1.

Промоторы = p = сайты связывания для РНК-полимеразы, с которых она инициирует транскрипцию. Существуют отдельные промоторы для гена lacI и генов lacZYA .
Оператор = o = сайт связывания репрессора; перекрывается с промоутером для lacZYA .
Репрессор , кодируемый геном lacI
Структурные гены : lacZYA

lacZ кодирует b-галактозидазу, которая расщепляет дисхарид лактозу на галактозу и глюкозу.

lacY кодирует пермеазу лактозы, мембранный белок, который способствует усвоению лактозы.

lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу; функция этого фермента в катаболизме лактозы не изучена (по крайней мере, мной)

C. Отрицательный контроль

Оперон lac находится под как отрицательный, так и положительный контроль . Их механизмы будут рассмотрены отдельно.

1. В отрицательном контроле гены lacZYA выключаются репрессором, когда индуктор отсутствует (сигнализируя об отсутствии лактозы). Когда репрессорный тетрамер связан с o , lacZYA не транскрибируется и, следовательно, не экспрессируется.

Рисунок 4.1.2. Репрессированный lac оперон

2. Когда присутствует индуктор (сигнализирующий о присутствии лактозы), он связывает репрессорный белок, тем самым изменяя его конформацию, уменьшая его сродство к o , оператор.Диссоциация комплекса репрессор-индуктор позволяет транскрибировать и, следовательно, экспрессировать lacZYA .

Рисунок 4.1.3. Индукция lac-оперона дерепрессией.

Индукторы

Натуральный индуктор (или антирепрессор) — это аллолактоза , аналог лактозы. Он образуется как побочный продукт метаболизма реакции, катализируемой β-галактозидазой. Обычно этот фермент катализирует расщепление лактозы до галактозы + глюкозы, но иногда он катализирует изомеризацию с образованием аллолактозы, в которой галакоза связана с C6 глюкозы вместо C4.

Бесплатный индуктор будет индуцировать оперон, но не метаболизируется кодируемыми ферментами; следовательно, индукция сохраняется дольше. Одним из наиболее распространенных препаратов, используемых в лаборатории, является синтетический аналог лактозы, называемый изопропилтиогалактозидом (IPTG). В этом соединении b-галактозидная связь связана с тиолом, который не является эффективным субстратом для b-галактозидазы.

E. Регуляторные мутанты

Регуляторные мутации влияют на количество всех ферментов, кодируемых опероном, тогда как мутации в структурном гене влияют только на активность кодируемого (одиночного) полипептида.

Репрессорные мутанты

а. Штаммы дикого типа ( lacI + ) являются индуцибельными .
г. Большинство штаммов с дефектным репрессором ( lacI- ) являются конститутивными , то есть они вырабатывают ферменты, кодируемые lac-опероном, даже в отсутствие индуктора.
г. Штаммы с репрессором, который не может взаимодействовать с индуктором ( lacI S ), являются неиндуцибельными .Поскольку индуктор не может связываться, репрессор остается на операторе и предотвращает экспрессию оперона даже в присутствии индуктора.
г. Вычеты по фенотипам мутантов

,00

Таблица 4.1.4. Фенотипы репрессорных мутантов
	β-галактозидаза		трансацетилаза
Генотип	-IPTG	+ IPTG	-IPTG	+ IPTG	Заключение
I + Z + A +	<0.1>	100	<1>	100	Индуктивный
I + Z-A +	<0,1>	<0,1>	<1>	100	lacZ кодирует b-галактозидазу
I-Z + A +	100	100	90	90	Учредительный
I + Z-A + / F ‘I-Z + A +	<0.1>	100	<1>	200	I + > I- в транс
IsZ + A +	<0,1>	<1>	<1>	<1>	Не индуцируемый
IsZ + A + / F ‘I + Z + A +	<0.1>	1	<1>	1	Это >. I + в транс

Оперон дикого типа индуцируется IPTG.
Мутация lacZ затрагивает только b-галактозидазу, но не трансацетилазу (или другие продукты оперона), показывая, что lacZ является структурным геном.
Мутация lacI затрагивает оба фермента, следовательно, lacI является регуляторным геном.Оба экспрессируются в отсутствие индуктора, следовательно, оперон экспрессируется конститутивно (штамм демонстрирует конститутивный фенотип).
В меродиплоидном штамме, в котором одна копия lac-оперона находится на хромосоме, а другая копия — на F ‘-факторе, можно проверить доминирование одного аллеля над другим. Дикий тип lacI + доминирует над lacI- в транс . В ситуации, когда единственный функциональный ген lacZ находится на той же хромосоме, что и lacI- , функциональный lacI все еще вызывает репрессию в отсутствие индуктора.
Аллель lacI S не индуцируется.
В меродиплоиде lacI S аллель доминирует над диким типом в tran s .

эл.Тот факт, что продукт гена lacI действует на trans , означает, что это диффундирующая молекула, которая может кодироваться на одной хромосоме, но действовать на другую, такую как F ‘хромосома в примере (d) выше. Фактически продукт гена lacI является белком-репрессором.

2. Оператор-мутанты

а. Дефекты оператора приводят к конститутивной экспрессии оперона, поэтому можно выделить конститутивных мутаций оператора , сокращенно o c . o + дикого типа индуцируются.

г. Мутации в операторе: cis, — действие; они влияют только на экспрессию структурных генов на одной и той же хромосоме.

(1) Меродиплоид I + o c Z + / I + o + Z 904 lacI + o c lacZ + / lacI + o + lacZ — ] выражает b-galacttively.Таким образом, o c является доминирующим для o + , когда o c находится в cis до lacZ + .

(2) Меродиплоид I + o c Z — / I + o + Z 904 b-экспрессия inactos . Таким образом, o + является доминирующим для o c , когда o + находится в cis до lacZ + .

(3) Аллель o , который находится в cis активного репортерного гена (то есть на той же хромосоме, что и lacZ + в данном случае), является аллелем, фенотип которого виден. Таким образом, действует оператор цис-, и это свойство упоминается как доминирование цис-. Как и в большинстве случаев регуляторных последовательностей цис , эти участки ДНК необходимы для регуляции. В этом случае оператор является сайтом связывания репрессорного белка, действующего на trans .

Взаимодействие между оператором и репрессором

Последовательность действий оператора

Оператор перекрывает стартовый сайт транскрипции и промотор. Он имеет симметрию диады с центром в +11. Такая диадная симметрия обычно обнаруживается в сайтах связывания для симметричных белков (репрессор — гомотетрамер). Последовательность ДНК, составляющая оператора, определялась положением o C мутаций, а также нуклеотидов, защищенных от реакции с, например,грамм. ДМС, при связывании репрессора.

Рисунок 4.1.4.

2. Репрессор

а. Очищение

(1) Увеличьте количество репрессора в исходном материале на сверхэкспрессии.

Клетка дикого типа имеет всего около 10 молекул репрессорного тетрамера. Выделению и очистке белка в значительной степени способствовало использование мутантного штамма с мутациями ап-промотора для lacI , так что в каждой клетке присутствовало гораздо больше копий белка.Эта общая стратегия избыточного производства белка широко используется в схемах очистки. Теперь ген белка клонируется в векторе экспрессии, так что хозяин (в данном случае бактерии) производит большое количество белка — часто значительную долю от общего бактериального белка.

(2) Анализы на репрессор

[1] Связывание меченного радиоактивным изотопом IPTG (беспричинный индуктор) с репрессором

[2] Связывание радиоактивно меченной последовательности операторной ДНК с репрессором. Это можно контролировать по способности комплекса белок-ДНК связываться с нитроцеллюлозой (тогда как меченный радиоактивным изотопом мутантный фрагмент ДНК оператора, o c , плюс репрессор не будут связываться).Анализы сдвига электрофоретической подвижности теперь будут использоваться во многих случаях.

[3] Эта способность определенных последовательностей связываться с высоким сродством с желаемым белком часто используется для быстрого выделения белка. Сайт связывания можно синтезировать в виде дуплексных олигонуклеотидов. Они лигируются вместе с образованием мультимеров, которые затем прикрепляются к твердой подложке в колонке. Затем желаемый ДНК-связывающий белок может быть выделен с помощью аффинной хроматографии , используя сайт связывания в ДНК в качестве аффинного лиганда.

г. Изолированный функциональный репрессор представляет собой тетрамер ; каждый из четырех мономеров является продуктом гена lacI (т.е. является гомотетрамером).

г. ДНК-связывающий домен репрессора lac складывается в домен спираль-поворот-спираль . Мы рассмотрим эту структурную область более подробно в главе III. Это один из наиболее распространенных ДНК-связывающих доменов у прокариот, и аналогичный структурный домен (гомеодомен) обнаружен в некоторых регуляторах транскрипции эукариот.

3. Пункты связи между репрессором и оператором

а. При исследовании точек контакта между репрессором и оператором использовались те же методы, которые мы обсуждали ранее для картирования сайта связывания РНК-полимеразы на промоторе, например Анализы сдвига электрофоретической подвижности (связывается ли фрагмент ДНК?), следы ДНКазы (где связывается белок?) и анализы интерференции метилирования (метилирование каких пуринов предотвращает связывание?).Альтернативные схемы позволят идентифицировать сайты, в которых метилирование либо предотвращается, либо усиливается связыванием репрессора. Эти методы обеспечивают биохимическое определение оператора = сайта связывания репрессора.

г. Ключевые точки контакта (см. Рисунок 4.1.4.):

(1) находятся в симметрии диады.

(2) совпадают (во многих случаях) с нуклеотидами, которые при мутации приводят к конститутивной экспрессии. Обратите внимание, что последний является генетическим определением оператора и совпадает с биохимически определенным оператором.

(3) имеют тенденцию быть симметрично распределенными вокруг оси диады (+11).

(4) в основном находятся на одной стороне двойной спирали ДНК.

г. Частичное перекрытие между оператором и промотором первоначально предложило модель стерического вмешательства для объяснения механизма репрессии. Пока репрессор был связан с оператором, полимераза не могла связываться с промотором. Но, как будет показано в следующей главе, это , а не . РНК-полимераза может связываться с промотором lac , даже если репрессор связан с оператором lac .Однако полимераза не может инициировать транскрипцию при наложении на репрессор.

4. Конформационный сдвиг репрессора при связывании индуктора

а. Репрессор имеет два разных домена: один, который связывается с ДНК («головной убор», содержащий домен спираль-поворот-спираль), а другой, который связывается с индуктором (и другими субъединицами) (называемый «ядром»). петля «обл.

г. Эти структурные домены можно различить по фенотипам мутаций, которые в них происходят.

lacI -d предотвращает связывание с ДНК, приводит к конститутивной экспрессии.

lacI S предотвращает связывание индуктора, приводит к неиндуцибельному фенотипу.

г. Связывание индуктора с «ядром» вызывает аллостерический сдвиг в репрессоре, так что «головной убор» больше не может образовывать высокоаффинный комплекс с ДНК, и репрессор может диссоциировать (перейти к одному из многих конкурирующих неспецифических сайтов ).

Положительный контроль: «катаболическая репрессия»

1. Катаболит репрессия

а. Даже бактерии могут быть разборчивы в том, что они едят. Глюкоза является предпочтительным источником углерода для E. coli ; бактерия будет потреблять доступную глюкозу перед использованием альтернативных источников углерода, таких как лактоза или аминокислоты.

г. Глюкоза приводит к подавлению экспрессии lac и некоторых других катаболических оперонов. Это явление называется катаболитной репрессией .

2. Два компонента необходимы для этой формы регулирования

а. лагерь

[1] В присутствии глюкозы [цАМФ] внутри клетки уменьшается с 10-4 М до 10-7 М. Высокий [цАМФ] снимает репрессию катаболита.

[2] Синтез цАМФ катализируется аденилатциклазой (продукт гена cya )

ATP ® cAMP + PP _i

г. Белок-активатор катаболита = CAP

[1] Продукт гена cap , также называемый crp (белок рецептора цАМФ).

[2] Является димером

[3] Связывает цАМФ, а затем комплекс цАМФ-ЦАП связывается с ДНК в определенных сайтах

3. Сайт связывания для cAMP-CAP

а. В lac-опероне сайт связывания представляет собой область размером около 20 п.н., расположенную прямо перед промотором, от -52 до -72.

г. Пентамер TGTGA является важным элементом распознавания. Для lac-оперона сайт связывания представляет собой диаду с этой последовательностью по обе стороны диады.

г.Точки контакта между цАМФ-ЦАП и ДНК близки или совпадают с мутациями, которые делают промотор lac более не чувствительным к цАМФ-ЦАП.

г. cAMP-CAP связывается на одной стороне спирали.

Рисунок 4.1.5. Сайт связывания для cAMP-CAP

4. Связывание цАМФ-CAP с его сайтом повысит эффективность инициации транскрипции на промоторе

а. Промотор lac не является особенно сильным промотором.Последовательность -10, TATGTT, не соответствует консенсусу (TATAAT) в двух положениях.

г. В присутствии цАМФ-CAP РНК-полимераза будет более эффективно инициировать транскрипцию.

г. Промотор lac UV5 представляет собой мутацию повышающего промотора, в которой область -10 соответствует консенсусу. Lac-оперон, управляемый промотором UV5, будет достигать высокого уровня индукции без цАМФ-CAP, но промотор дикого типа требует цАМФ-CAP для индукции высокого уровня.

Рисунок 4.1.6. Регуляторная область lac-оперона, включая сайт связывания CAP

5. Механизм действия cAMP-CAP

а. Прямое положительное взаимодействие с РНК-полимеразой . С-конец α-субъединицы необходим для активации РНК-полимеразы с помощью цАМФ-CAP. Более подробно это будет рассмотрено в Главе 16.

г. cAMP-CAP изгибает ДНК примерно 90 o.

Рисунок 4.1.7. ДНК (верхняя спиральная структура) изгибается димером CAP.

Некоторые общие сведения

Репрессоры, активаторы и полимеразы взаимодействуют в основном с одной стороной двойной спирали ДНК.
Регуляторные белки, такие как активаторы и репрессоры, часто являются симметричными и связывают симметричные последовательности в ДНК.

РНК-полимеразы

не являются симметричными, и промоторы, с которыми они связываются, также асимметричны. Это придает транскрипции направленность.

Авторы и авторство

Руководство по пониманию экспрессии генов

Способность анализировать паттерны экспрессии генов имеет важное значение для понимания функции белков, биологических путей и клеточных реакций на внешние и внутренние раздражители. Эта статья призвана предоставить краткий обзор процессов, лежащих в основе экспрессии генов, и методов, которые можно использовать для количественной оценки экспрессии конкретных генов.

Экспрессия гена.Кредит изображения: udaix / Shutterstock.com

Что такое экспрессия гена?

Экспрессия гена контролирует количество и тип белков, которые экспрессируются в клетке в любой момент времени. Это, в свою очередь, контролируется регуляторными механизмами, которые контролируют синтез и деградацию белков в рамках пути.

Процесс генной регуляции включает 1) транскрипцию, преобразование ДНК в РНК и 2) трансляцию, преобразование РНК в белки. Помимо экспрессии генов, уровни белка также могут определяться количеством РНК в клетке.

ДНК в РНК: транскрипция

Первоначально транскрипция ДНК

наблюдалась с помощью метода электронной микроскопии в 1970 году. Разрешение этих ранних микроскопов было низким, и ДНК выглядела как «ствол» с протяженными ветвями нуклеиновых кислот. Добавление ДНКаз приводило к деградации стволов, в то время как РНКазы удаляли ответвления.

Хотя молекулы ДНК двухцепочечные, только одна цепь действует как матрица для процесса транскрипции. Эта прядь называется «прядью-шаблоном».«Неэлементная» цепь называется кодирующей цепью, поскольку последовательность этой цепи такая же, как и последовательность генерируемой молекулы РНК. Во многих случаях матричная цепь для одного гена также может быть некодирующей цепью для других генов, присутствующих в хромосоме.

Процесс транскрипции начинается с присоединения РНК-полимеразы к матричной цепи ДНК, что приводит к образованию комплементарных молекул РНК. РНК-полимеразы — это большие молекулы, которые состоят из почти дюжины субъединиц вместе с другими факторами, когда они прикреплены к цепи ДНК.

Количество полимераз различается у прокариот и эукариот: бактерии (которые являются прокариотами) имеют только одну РНК-полимеразу, в то время как эукариотические клетки имеют РНК Pol I, II и III. РНК Pol I кодирует 47S рибосомную РНК, РНК Pol II кодирует информационные РНК, а РНК Pol III кодирует 5S рибосомную РНК и транспортную РНК.

Инициирование, удлинение и прекращение

Во-первых, РНК-полимераза связывается с областью, расположенной выше фактической кодирующей последовательности. Этот регион называется промоутером.Для связывания с ДНК РНК Pol связывается с субъединицей «сигма», образуя холофермент, который может раскручивать двойную спираль ДНК.

Раскрутка необходима для доступа к гену, а сигма-фактор гарантирует, что Pol РНК связывается с правильной областью ДНК. По мере того как транскрипция продолжается, спираль раскручивается, РНК Pol считывает матрицу и добавляет нуклеотиды на 3 ’конце.

В среднем 42-54 нуклеотида добавляется в секунду при температуре 37 ° C. Этот шаг (известный как удлинение) координирует несколько событий, некоторые из которых предотвращают ошибки во время этого процесса.

Терминация может быть двух типов: в Rho-независимой терминации присутствие инвертированных повторяющихся последовательностей заставляет транскрибируемые последовательности РНК складываться на себя, образуя петли шпильки. Это приводит к отсоединению pol РНК, что приводит к завершению. В случае Rho-зависимой терминации, rho-фактор высвобождает вновь образованную мРНК из ДНК, раскручивая ее.

РНК в белок: трансляция

Транскрипция производит одну молекулу мРНК, которую можно определить как одноцепочечную копию гена.Затем мРНК подвергается трансляции с образованием белка. Каждые три основания в последовательности мРНК составляют аминокислоту — таким образом, трансляция дает последовательность аминокислот.

Процесс трансляции происходит в рибосоме. Итак, после процесса транскрипции, который происходит в ядре, мРНК перемещается за пределы ядра к рибосоме. У прокариот, поскольку нет разделения или компартментализации ядра, процесс трансляции начинается, даже когда ДНК транскрибируется.

Рибосома состоит из двух субъединиц: маленькой и большой. Субъединица меньшего размера и РНК переноса инициатора (тРНК) собираются на цепи мРНК. Маленькая субъединица имеет аминокислотный сайт (A), полипептидный сайт (P) и сайт выхода (E). Аминоацил-тРНК связывается с мРНК в сайте A. В сайте P аминокислота переносится от тРНК к полипептидной цепи.

Наконец, E или сайт выхода — это позиция пустой тРНК до того, как она попадет в цитоплазму. Три кодона терминации на конце последовательности мРНК, кодирующей белок, представляют собой UAA, UAG и UGA.Это означает терминацию, поскольку нет тРНК, распознающих эти кодоны.

Кредит изображения: Meletios Verras / Shutterstock.com

Сплайсинг РНК: несколько белков из одной последовательности РНК

В случае эукариотических генов РНК, изначально созданная из матрицы ДНК, подвергается процессингу до того, как будет создана зрелая информационная РНК. Этот процессинг включает сплайсинг РНК, при котором определенные последовательности «сплайсируются» или «удаляются».

Эти последовательности представляют собой интроны, которые не являются кодирующими по своей природе.Последние последовательности, оставшиеся в мРНК, представляют собой кодирующие последовательности или экзоны. Интроны расщепляются в сайтах, называемых сайтами сплайсинга, которые присутствуют на 5′- и 3′-концах интронов.

Общая последовательность РНК включает нуклеотид GU на 5 ’конце и AG на 3’ конце. Эта последовательность очень важна, поскольку любое изменение может препятствовать процессу приправки.

Процесс сплайсинга катализируется небольшими рибонуклеопротеинами, известными как «мяРНП» (обычно произносится как «snurps»), и происходит в клеточных машинах, называемых сплайсосомами.Концепция сплайсинга делает гены более «модульными», когда новые комбинации экзонов могут генерировать новые белки, не изменяя и не разрушая старые гены.

Измерение и количественная оценка экспрессии генов

Идентичность и уровни экспрессируемых генов могут иметь решающее значение для понимания любого биологического процесса. Поскольку в любой момент времени экспрессируется только небольшая часть генов, важно оценить профиль экспрессии генов.

Для количественной оценки изменений уровней мРНК необходимо достаточное количество общей или информационной РНК, зонды, специфичные для требуемых последовательностей, необходимые средства контроля, а также чувствительный метод обнаружения.В настоящее время два основных метода количественного определения уровней мРНК включают электрофоретические методы (такие как Нозерн-блоттинг), ДНК-микрочип и количественная ПЦР.

Нозерн-блот

Нозерн-блоттинг — широко используемый инструмент. Его преимущество заключается в том, что размер транскрипта получают с помощью гель-электрофореза. Это обеспечивает грубый метод проверки точности зонда, а также идентифицирует варианты сплайсинга, присутствующие в образце РНК. Однако это трудозатратно, и большое количество шагов позволяет вкрасться большему количеству экспериментальных ошибок.

ДНК-микрочипы

Отправной точкой микроматрицы ДНК является создание массива последовательностей, соответствующих генам, которые необходимо исследовать. Эти олигонуклеотиды синтезируются химическим путем, и для каждого гена можно сконструировать несколько таких зондов. Теперь можно автоматически печатать зонды кДНК на предметном стекле. Используя этот метод, можно получить полный профиль экспрессии гена в одном эксперименте.

ПЦР в реальном времени

Мощным методом измерения уровней мРНК является кинетическая ПЦР или ПЦР в реальном времени.В этом методе накопленные продукты ПЦР отслеживаются в конце каждого цикла с помощью флуоресценции.

Флуоресценция изначально неотличима от фона; однако после определенного количества циклов флуоресценция начинает экспоненциально возрастать, прежде чем выйти на плато. Это увеличение флуоресценции можно использовать для количественного определения уровней мРНК.