Экспрессия это в медицине: Недопустимое название — Викисловарь

Содержание

Экспрессия — что это и как она проявляется? Что такое экспрессия, формы ее проявления

Экспрессия начинается там, где заканчивается мышление, так сказал Альбер Камю, а мы могли бы добавить — и начинаются эмоции. Действительно, на вопрос, что такое экспрессия, можно ответить со стороны психологии, искусства и даже генной инженерии. Но суть, ядро этого слова, заключено в одном очень экспрессивном существительном — чрезвычайности. Чрезвычайности мыслей, движения, образа жизни, порывов, скорости. Пожалуй, с этого и начнем.

Что такое экспрессия

Латинское слово ex-pressio, то есть — выдавливание, выжимание, нагнетание, заставляет посмотреть на знакомое нам понятие с другой стороны. То есть буквально слово экспрессия означало насильственное вызывание каких-либо чувств и эмоций.

Наши словари трактуют это яркое слово иначе и ближе для привычного восприятия — выразительность, чувственность, эмоциональность на грани обнажения личности.

Но по факту экспрессия — это довольно капризный диагноз, который выносится в определенном соответственно параметрам, принятым в этом обществе за норму. Допустим, нет ничего предосудительного для русского человека в том, чтобы, здороваясь со знакомым, придержать его руку в своей. Для истинного британца, как-то не воспитанного на дружественных телесных контактах, такой жест будет выглядеть экспрессивным, если не сказать — ненормальным.

Экспрессия в психологии

Психология не считает, что экспрессия — такое чувственно-эмоциональное поведенческое проявление, ведь человек, демонстрируя себя, преподносит значительную часть своей личности не в словах или поступках, а в собственном облике. Сила чувств, наше самовыражение, основанное на прочном фундаменте из убеждений, привычек, и «эмоциональной слепоте» (зрительно оцениваем окружающих, но не себя), — все это откладывается на манере одеваться, носить макияж, опрятности или неряшливом виде.

Экспрессивная личность присутствует в каждом, ведь синонимами экспрессии являются колоритность, сочность, живость натуры, а нет ни одного человека, периодически не испытывающего в себе яркого подъема, силы, рельефности — каждому знакомо это чувство, горячей волной поднимающееся изнутри. Только кому-то достаточно выпить чашечку кофе, чтобы подняться на высоту эмоций, а кому-то нужно совершить внутреннее преодоление, добиться признания.

Экспрессия в искусстве

Самое наглядное и выразительно проявление экспрессии мы встречаем в искусстве, будь то волнующая картина, скрипичный концерт или зажигательный танец. Для оценки произведения как примера экспрессии не нужно вдаваться в анализ. Если вы ощутили в себе душевное движение, значит, то, что вызвало его, — экспрессивно в той или иной мере.

С его «живыми» иконами, Иероним Босх, переворачивающий сознание невиданной жутью своих полотен, — экспрессионисты. Майкл Флетли, почти забытый Король Айседора Дункан — экспрессионисты. Эпохой экспрессионизма считают расцвет готического направления в Западной Европе, а сейчас того же титула удостоились творческие плоды направления hi-tech.

Зеркало личности

Внутреннюю экспрессию спрятать невозможно, потому что человек не способен отказаться от своей личности. Злой нелюдимый затворник сможет поменять истинное лицо на маску добродушного «соседушки», но не пройдет и десяти минут, как угрюмость начнет продираться сквозь улыбку. Это то же самое, как если калека вдруг начнет притворяться здоровым. Поверят ли ему?

Что такое экспрессия и как она работает, хорошо наблюдать на революционно настроенных людях, генераторах энергии и маятниках, раскачивающих весь окружающий мир вокруг себя. Их секрет в направленном действии своего душевного подъема, в том, что свою искру они несут с уверенным пониманием того, что она светит и греет, а не стыдливо пряча ее под полой. Поэтому основной синоним экспрессии, стоящий на первом месте, — это яркость. Яркая личность всегда экспрессивна, ибо обнаженность чувств есть зеркало — всякий глядящий в него увидит суть. В зеркало же, занавешенное комплексами и предрассудками, затянутое паутиной, и глядеть никому не хочется.

Универсальный язык

Лексическое значение экспрессии — это выразительное, яркое проявление эмоций и личных качеств человека.

Экспрессия здорового человека всегда адаптивна к обществу, образующему культурную ячейку. Смех — нормальная реакция на шутку, и он будет понят как жителем Африки, так и австралийским поселенцем. Но продолжительность естественной реакции на анекдот, сила ее проявления и характер дополнительных жестов регулируются принципами допустимого в конкретной среде. Относится это и к прочим примерам универсального языка экспрессивности: плачу, грусти, радости, восторгу, страху.

Регулируемые социумом нормы не кажутся сильно ограничивающими, но лишь потому, что каждый из нас воспитан в понятиях того, что позволительно, а что нет. Люди, внутренний мир которых не вписывается в установленные рамки, и есть истинные экспрессионисты.

Экспрессия генов

Что такое экспрессия генов, можно понять, только зная приблизительное строение клетки и ту информацию, которую она несет.

Любой человек — из плотно подогнанных клеток, и всего их в пределах 50 трлн. Внутри каждой клетки находится ядро, но само по себе оно только оболочка для ценного набора ДНК, образующего цепочку вокруг концентрата нашей личности — хромосомы. Информация в хромосоме — это сведения о цвете наших глаз, о форме ногтей, о сухости или жирности кожи. Эти сведения не слиты в единый резервуар, а строго разделены на кирпичики — гены. Если только представить, что комплект каждой клетки содержит 20 тыс. генов, то становится понятной сложность каждой личности в отдельности. Мы просто обязаны быть индивидуальностями, обладая таким спектром противопоставлений.

Как и у людей, у каждого из генов есть своя обязанность, которую он «вывозит» или нет. Кто-то регулярно совершает переработку, а кто-то скромно отмалчивается в стороне. И это и есть, собственно, экспрессия генов — характер их активности. Это нельзя назвать отклонением — невозможно всем работать с одинаковой скоростью, и неизменно часть генов будет обладать высокой экспрессией, а часть — низкой. Это не хорошо и не плохо, это абсолютная норма.

Наука, изучающая экспрессию генов, — генная инженерия, ставит впереди себя задачи, знакомые нам разве что по фантастическим фильмам. Одной из целей, возложенных на изучение генной экспрессии, является вечная молодость.

«Какая экспрессия!» — восхищенно выдохнет ценитель искусства, глядя на картину художника. «Очень экспрессивная девушка!» — скажет человек о своей собеседнице, эмоционально рассказывающей о взволновавшем ее событии. Что же такое экспрессия? Это понятие встречается в искусстве и в медицине, в биологии и в психологии. Мы употребляем его, когда говорим о чем-то ярком, динамичном и очень эмоциональном.

Понятие «экспрессия» происходит от латинского слова «выражение» — expression. Не стоит путать с espresso – способом приготовления крепкого кофе. В психологии под экспрессией понимается процесс демонстрации эмоций, трансляция их окружающим, то есть эмоциональная выразительность.

Отражают отношение человека к окружающему миру и к самому себе. Их центры находятся в древней подкорковой зоне головного мозга, что объясняет связь наших эмоциональных состояний с различными физиологическими функциями организма. Когда человек переживает сильные чувства, происходят изменения в сердечно-сосудистой системе, пищеварительной, гормональной и т. д.

Эти изменения могут быть визуально заметны, они показывают, какие чувства и настроения испытывает человек. Например, мы замечаем бледность кожи испуганного человека или покрасневшие от смущения щеки, дрожащие от волнения пальцы рук или выступивший на лбу пот, не говоря уже об улыбке, смехе и слезах. Все это экспрессивные реакции, выражающие эмоциональное состояние.

Кстати, они характерны не только для человека, но и для высших животных, что свидетельствует о древности выразительных движений:

  • вздыбленная шерсть, подергивание хвоста у кошек;
  • очаровательная улыбка или оскал собак и т. д.

Но экспрессия человека только этими, во многом рефлекторными реакциями не ограничивается.

Формы экспрессии

Эмоции и формы их выражения играют важную роль в , без них невозможно взаимопонимание людей. Недаром же замкнутый, скрывающий свои чувства человек вызывает недоверие и подозрительность.

Мимика

Выражение лица – это первое, что мы замечаем, встречаясь с человеком. Особенно привлекают внимание глаза. Экспериментально было установлено, что даже рассматривая портрет человека на картине, зритель постоянно обращается взглядом к его глазам.

С помощью выражения глаз – изменения их формы, размера зрачка, движений, свечения радужки – человек может передавать самые разные чувства. Так, Л. Н. Толстой в своих произведениях описал 85 разных выражений глаз. Взгляд может быть огненный, пылающий и холодный, ледяной, в нем может сверкать ненависть и отвага или застыть презрение, он способен светиться любовью или потухнуть от горя.

Экспрессия человеческих глаз имеет потрясающую силу, недаром же зрительный контакт считается самым мощным средством эмоционального воздействия. Поэтому прямой взгляд в глаза в древности считался угрозой, да и сейчас нередко расценивается как демонстрация человеком своего превосходства. А стремящийся что-то скрыть человек старается не смотреть собеседнику в глаза, трус и индивид тоже отводит взгляд.

Второе по значимости место среди мимических средств занимает . И если мы снова обратимся к творчеству Л. Н. Толстого, то в его произведениях сможем найти описание 97 оттенков улыбки. Это экспрессивное движение настолько важно в общении, что существуют специальные тренинги, где людей учат правильно улыбаться.

Всего на лице человека находится 57 мимических мышц, движения которых могут выражать неисчислимое количество разнообразных чувств и настроений. Кстати, в улыбке могут быть задействованы 53 мышцы из этих 57. Поэтому научиться красивой, искренней улыбке совсем непросто. Для того чтобы с ее помощью передать радость от общения с собеседником, нужно эту радость действительно испытывать.

Пантомимика

Включает всю совокупность телодвижений, жестов и поз, которые участвуют в выражении эмоций. Характер движений человека вообще рефлекторно меняется в зависимости от его настроения. Жестикуляция, положение тела в пространстве, походка выдают наши чувства, даже если мы того не желаем.

  • Грустный, подавленный человек идет шаркающей походкой, опустив плечи и голову, он практически не жестикулирует, словно у него нет сил на это.
  • Для счастливого и бодрого человека характерна уверенная, пружинистая походка и широкий шаг. Он идет, словно танцует, и жестикуляция у него свободная и широкая, кажется, он готов обнять весь мир.
  • Резкие, рубящие жесты, напряженные, плохо скоординированные движения выдадут разозленного человека.

Наиболее заметна в общении экспрессия рук, их движения дополняют или опровергают то, что говорит человек, но они всегда очень информативны. Округлые, плавные движения руками бывают у спокойного человека в доброжелательном настроении. Прося о помощи, мы протягиваем руки открытыми ладонями к собеседнику, защищаясь, скрещиваем руки на груди, а злясь, сжимаем кулаки.

О пантомимике как форме экспрессивных движений можно говорить очень долго, недаром же языку телодвижений посвящены целые книги.

Вербальная (речевая) экспрессия

Не только движения, но и речь человека буквально пропитана эмоциями. В любом языке существует множество слов для передачи чувств и настроений, причем это разные части речи – существительные, глаголы, прилагательные, наречия и т. д.

  • гнев – сердитый – гневаться;
  • радость – радоваться – радостный – радостно;
  • возлюбленный – любовь – любить;
  • презирать – презренный – презрение и т. д.

А если к словам добавить традиционные в русском языке приставки и суффиксы, то становится ясно, что с помощью только вербальных средств можно выразить разнообразные оттенки и нюансы эмоциональных состояний. Это успешно используют талантливые писатели, заставляя читателей переживать и радоваться, смеяться и плакать, возмущаться или скучать.

Настроения и чувства можно передать и с помощью слов, не относящихся к эмоциональной лексике. В русском языке для этого нужно только использовать соответствующие суффиксы и приставки. Например:

  • рука – рученька – ручонка – ручища;
  • тихо – тихонько – тихонечко;
  • кот – котик – котище – котяра;
  • большой – большенький – большущий – большученный и т. д.

А можно так построить фразу, что экспрессия в ней будет выражена с помощью сочетания слов. Например: «Эх, какой же грандиозный писатель» или «Это не человек, а ураган какой-то!»

Экспрессия речи проявляется в усилении ее эмоциональности, и лексика – это лишь одно из средств. Не менее важную роль играют экстра- и паралингвистика. Паралингвистика – это интонационные особенности нашего голоса, его тембр и громкость. С помощью интонации мы можем передавать разнообразные чувства и настроения, и нередко ее экспрессия значит даже больше, чем содержание самого речевого высказывания. Думаю, вы не раз сталкивались с ситуацией, когда собеседник уверяет, что у него все в порядке, но, судя по его голосу, это далеко не так.

Одной только интонации без слов достаточно для выражения эмоций, поэтому мы можем понять чувства иностранца. Экспрессивность интонации используется в музыке, которая, по сути, ее копирует.

Громкость и тембр речи тоже связаны с эмоциями:

  • слишком громкий голос свидетельствует о повышенном эмоциональном возбуждении;
  • тихий – о низком эмоциональном тонусе;
  • дрожащий – о страхе или неуверенности;
  • визгливый – о раздражении и злости;
  • мягкий, бархатный о положительном настрое на собеседника;
  • хриплый – смесь возбуждения и тревоги.

Экстралингвистика – это паузы и различные звуки, которые сопровождают речь. Главная функция экстралингвистики – экспрессивная, она передает эмоции в чистом виде, и к ней относятся различные многозначные паузы, ахи, охи, вздохи, плач, смех и т. д.

Экспрессия в искусстве

Искусство – это одна из форм общения людей, передающая в первую очередь эмоциональную информацию. Есть такая точка зрения, что искусство родилось из людей в сильных эмоциях, точнее в тех, что им не хватает в реальности. И часто экспрессивная функция является основной для произведений искусства.

  • Главным образом это относится к музыке, которая для передачи настроения использует интонации человеческой речи. И музыка способна не только передавать чувства, но и пробуждать их у человека, вызывать эмоциональный резонанс.
  • Более сложными и неоднозначными экспрессивными средствами обладает изобразительное искусство. Оно воздействует на эмоциональную сферу человека с помощью цветовой гаммы, экспрессии мазков и динамики линий. Долгое время экспрессивной стороне живописи не придавалось серьезного значения, так как целью этого вида искусства считалось максимально реалистичное изображение мира. Изменили эту точку зрения на рубеже XIX-XX веков художники-импрессионисты, которые стали использовать изобразительные средства (главным образом цвет) для передачи нюансов настроения.
  • Танец и балет используют экспрессию движений, которые не менее выразительны, чем звуки, слова и краски.
  • В литературе главную роль играют выразительные способности слова.
  • А вот театр может использовать всю палитру экспрессивных средств, доступных человеку.

Экспрессивность как качество личности

Способность человека с помощью передавать свои эмоциональные состояния называют экспрессивностью. В той или иной степени это качество присуще всем людям. Но некоторые личности настолько ярко и бурно демонстрируют свои чувства, что о них говорят как об экспрессивных натурах.

Уровень экспрессивности зависит не только и не столько от ситуации или состояния человека, сколько от его . Они являются устойчивыми, часто носят врожденный характер и связаны с темпераментом. К таким свойствам личности, определяющим ее повышенную экспрессивность, относятся следующие:

  • возбудимость нервной системы; преобладание возбуждения над торможением, что свойственно ;
  • подвижность нервных процессов, что приводит к быстрой смене настроения;
  • высокая скорость реакций – моментально все чувства отражаются на лице, в движениях и интонации;
  • высокий уровень активности – энергичные и деятельные сангвиники, как правило, более экспрессивны, чем флегматики;
  • чувствительность нервной системы, которая приводит к бурным эмоциональным реакциям даже на незначительные раздражители.

Экспрессивность человека зависит также еще от нескольких факторов. Например, от пола и возраста. Женщины обычно более экспрессивны, чем мужчины, так как у них подвижнее нервная система. Дети эмоциональнее, чем взрослые, они легко возбуждаются и не привыкли скрывать свои чувства. Поэтому их экспрессия намного заметнее.

Интересно, что уровень экспрессивности зависит и от национальной принадлежности человека. Это связано как с психологическим фактором (национальным характером), так и с культурным – традициями и обычаями. Так, более экспрессивные народы живут на юге. Думаю, все представляют, как бурно жестикулируют и выражают свои эмоции испанцы, португальцы, итальянцы, жители Латинской Америки и кавказские народы. А как экспрессивно поют и танцуют индусы! Эмоциональные по природе японцы сдержаны, так как этого требуют их культурные традиции. А вот жители Северной Европы, особенно Скандинавии и Прибалтики, экспрессивностью не отличаются.

Экспрессия не просто играет важную роль во взаимодействии людей, многие психологи считают ее ядром . Способность человека выражать свои эмоции и управлять процессом экспрессии сыграла важную роль в эволюции homo sapiens и в развитии цивилизации.

Экспрессия

Выразительность; сила проявления чувств, переживаний. Экспрессивные реакции являются внешним проявлением эмоций и чувств человека — в мимике, пантомимике, голосе и жестах. Хотя экспрессия у человека генетически детерминирована, она сильно зависит от процесса научения, направляемого нормами социальными/При этом могут возникнуть определенные формы экспрессии, не имеющие никакой «природной» связи с некоей эмоцией.
Формы экспрессии у лиц одной культуры относительно однородны. Существуют и универсальные формы экспрессия, что могут быть понятны людям разных культур, и те, что можно понять лишь в рамках данной культуры. Так, слезы — почти универсальный признак горя и печали, но форму этой реакции — когда, как и сколь долго можно плакать — определяют нормы культуры. Экспрессия сильно влияет на характер отношений межличностных. Избыточная или недостаточная экспрессия, ее неадекватность конкретной ситуации могут стать одним из источников конфликтов.

Словарь практического психолога. — М.: АСТ, Харвест
.
С. Ю. Головин
.
1998
.

ЭКСПРЕССИЯ

(англ. expression —
выражение, напр. лица, глаз; изображение).

1. Любой внешний показ, демонстрация, имитация с помощью движений, поз и звуков.

2. Непосредственно наблюдаемые внешние сигналы и знаки, информирующие о внутреннем состоянии субъекта. Напр., эмоциональная
Э. — сигналы и знаки
(вербальные, жестовые, мимические), информирующие об эмоциональном состоянии субъекта; речевая
Э. — способность речи выражать психическое состояние говорящего (в т. ч. эмоциональное).

Большой психологический словарь. — М.: Прайм-ЕВРОЗНАК
.
Под ред. Б.Г. Мещерякова, акад. В.П. Зинченко
.
2003
.

Синонимы
:

Смотреть что такое «экспрессия» в других словарях:

    ЭКСПРЕССИЯ
    — (лат., от exprimere выражать). Выразительность: в живописи, в музыке, сценической игре и проч. Словарь иностранных слов, вошедших в состав русского языка. Чудинов А.Н., 1910. ЭКСПРЕССИЯ выразительность, преимущ. в сценич. игре и в живописи.… … Словарь иностранных слов русского языка

    экспрессия
    — См … Словарь синонимов

    экспрессия
    — и, я. expression f. <, лат. expressio выражение. 1. устар. Выражение, слово. Если на пассаж <пасквиля>, до меня касающийся, ответствовать труд заслуживает, всенижайше предлагаю, не употребить ли следующих, или тому подобных экспрессий:… … Исторический словарь галлицизмов русского языка

    Экспрессия
    — * экспрэсія * expression 1. . 2. Синтез белка в клетке, который кодируется геном, конкретным для каждого из белков. Процесс Э. включает в себя транскрипцию ДНК, процессинг полученного продукта мРНК и его трансляцию в активный белок. В этом случае … Генетика. Энциклопедический словарь

    ЭКСПРЕССИЯ
    — [рэ], эксрессии, мн. нет, жен. (лат. expressio выражение) (книжн.). То, что придает выразительность чему нибудь, что делает что нибудь выразительным. Он спел романс о большой экспрессией. Экспрессия жеста, лица, слова. «Вы поглядите, сколько… … Толковый словарь Ушакова

    экспрессия
    — экспрессия. Произносится [экспрэссия] и [экспрессия] … Словарь трудностей произношения и ударения в современном русском языке

    ЭКСПРЕССИЯ
    — ЭКСПРЕССИЯ, выразительность; яркое, значительное проявление чувств, настроений, мыслей … Современная энциклопедия

    ЭКСПРЕССИЯ
    — выразительность; яркое, значительное проявление чувств, настроений, мыслей … Большой Энциклопедический словарь

    ЭКСПРЕССИЯ
    — ЭКСПРЕССИЯ, и, ж. (книжн.). Выражение чувств, переживаний, выразительность. Декламировать с большой экспрессией. Толковый словарь Ожегова. С.И. Ожегов, Н.Ю. Шведова. 1949 1992 … Толковый словарь Ожегова

    экспрессия
    — (гена) Тематики биотехнологии EN expression … Справочник технического переводчика

Книги

  • Жест и экспрессия , Пасквинелли, Барбара. В этой энциклопедии «душевные движения», выраженные языком тела — жесты, позы, экспрессия — рассматриваются сквозь призму изобразительного искусства; их смысл и значение объясняется на…

Различными путями — неотъемлемая часть жизни человека в обществе. Достаточно оглянуться вокруг, чтобы увидеть, насколько различаются внешние проявления эмоций у разных людей: на один и тот же анекдот один человек лишь хмыкнет, в то время как его товарищ разразится неудержимым смехом. Говоря о силе и выразительности проявления чувств, психологи употребляют слово «экспрессия», которое, впрочем, сейчас шагнуло далеко за рамки психологии. Но при этом, употребляя его, мало кто задумывается, что такое «экспрессия» на самом деле.

Определение с точки зрения психологии

Основное значение слова «экспрессия», используемое в психологии, — выразительность, сила проявления чувств и переживаний. Здесь ее делять на несколько аспектов, в совокупности представляющих собой так называемую кинесику — зрительно воспринимаемый диапазон движений, несущих информацию как с точки зрения только одного из участников общения, так и с точки зрения всех людей, участвующих в коммуникации.

Составляющие экспрессии человека

В современной психологии решение вопроса о том, что такое экспрессия, неотделимо от изучения ее компонентов — выразительных движений, изменяющихся согласно состоянию человека и его отношению к происходящему. Здесь можно выделить две классификации, отечественную и принятую в зарубежной психологии. В отечественной психологии выделяются следующие составляющие человеческой экспрессивности, иногда называемые «средствами экспрессии»:

  • выразительные движения лица — его мимика;
  • пантомимика — совокупность выразительных движений тела, включающая в себя позу, походку, жесты;
  • вокальная мимика человека — выражение эмоций через интонации и изменение тембра голоса.

Совокупность этих аспектов отечественные психологи называют экспрессивным репертуаром человека. Англо-американская психологическая традиция рассматривает исключительно кинесику — воспринимаемые визуально смыслово-значимые движения человека. Здесь рассматриваются жесты, движения глаз и позы, каждое из которых в определенной культуре имеет свое смысловое значение. Культурная разница также учитывается в психологии при сборе данных о способах выражения чувств разными людьми. В целом набор жестов и интонаций отслеживается, осознается и контролируется человеком, что обеспечивает ему более простое донесение своих чувств до собеседника, а также способствует достижению целей.

Экспрессивность как качество личности

Ответив на вопрос о том, что такое экспрессия, следует отдельно рассмотреть такую значимую часть человеческого «Я», как экспрессивность. Под экспрессивностью личности подразумевают умение человека живо и выразительно показать окружающим свои чувства и эмоции. Чем более выражено это качество, тем более эмоциональным кажется человек. Человека с минимальной выраженностью экспрессивности принято называть сдержанным. Как правило, такие люди достаточно скупы в жестах, их лицо отражает достаточно мало эмоций, да и те не слишком отчетливы, интонации их голоса ровны и мало подвержены изменениям под воздействием чувств, которые могут кипеть внутри человека.

Другие значения слова

Помимо основного, психологического смысла, слово «экспрессия» имеет еще несколько значений, также достаточно употребляемых в речи. Экспрессией называют выразительность чего-либо: жестов, слов, действий на сцене или в какой-то ситуации. Иногда подразумевается излишне подчеркнутая, в чем-то даже избыточная выразительность. Кроме этого, слово имеет также отдельное значение, в котором его употребляют для обозначения биологического процесса. Биолог, отвечая на вопрос о том, что такое экспрессия, скажет, что это преобразование информации от гена в определенный белок или РНК.

— (лат., от exprimere выражать). Выразительность: в живописи, в музыке, сценической игре и проч. Словарь иностранных слов, вошедших в состав русского языка. Чудинов А.Н., 1910. ЭКСПРЕССИЯ выразительность, преимущ. в сценич. игре и в живописи.… … Словарь иностранных слов русского языка

экспрессия
— выразительность; сила проявления чувств, переживаний. Экспрессивные реакции являются внешним проявлением эмоций и чувств человека в мимике, пантомимике, голосе и жестах. Хотя экспрессия у человека генетически детерминирована, она сильно зависит… … Большая психологическая энциклопедия

См … Словарь синонимов

экспрессия
— и, я. expression f. <, лат. expressio выражение. 1. устар. Выражение, слово. Если на пассаж <пасквиля>, до меня касающийся, ответствовать труд заслуживает, всенижайше предлагаю, не употребить ли следующих, или тому подобных экспрессий:… … Исторический словарь галлицизмов русского языка

Экспрессия
— * экспрэсія * expression 1. . 2. Синтез белка в клетке, который кодируется геном, конкретным для каждого из белков. Процесс Э. включает в себя транскрипцию ДНК, процессинг полученного продукта мРНК и его трансляцию в активный белок. В этом случае … Генетика. Энциклопедический словарь

— [рэ], эксрессии, мн. нет, жен. (лат. expressio выражение) (книжн.). То, что придает выразительность чему нибудь, что делает что нибудь выразительным. Он спел романс о большой экспрессией. Экспрессия жеста, лица, слова. «Вы поглядите, сколько… … Толковый словарь Ушакова

экспрессия
— экспрессия. Произносится [экспрэссия] и [экспрессия] … Словарь трудностей произношения и ударения в современном русском языке

Выразительность; яркое, значительное проявление чувств, настроений, мыслей … Большой Энциклопедический словарь

ЭКСПРЕССИЯ, и, ж. (книжн.). Выражение чувств, переживаний, выразительность. Декламировать с большой экспрессией. Толковый словарь Ожегова. С.И. Ожегов, Н.Ю. Шведова. 1949 1992 … Толковый словарь Ожегова

экспрессия
— (гена) Тематики биотехнологии EN expression … Справочник технического переводчика

Книги

  • Жест и экспрессия , Пасквинелли, Барбара. В этой энциклопедии «душевные движения», выраженные языком тела — жесты, позы, экспрессия — рассматриваются сквозь призму изобразительного искусства; их смысл и значение объясняется на…
  • Жест и экспрессия , Барбара Пасквинелли. В этой энциклопедии «душевные движения», выраженные языком тела — жесты, позы, экспрессия — рассматриваются сквозь призму изобразительного искусства; их смысл и значение объясняется на…

Исследование особенностей экспрессии и распространённости раково-тестикулярных генов

На правах рукописи

МИСЮРИН ВСЕВОЛОД АНДРЕЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЭКСПРЕССИИ И РАСПРОСТРАНЁННОСТИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРВЫХ ГЕНОВ

Специальность: 14.01.12 — Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 2014

МОСКВА, 2014

005556775

005556775

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Директор

академик РАН

Давыдов Михаил Иванович

Научный руководитель:

профессор, доктор медицинских наук

Барышников Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты:

Голенков Анатолий Константинович — профессор, доктор медицинских наук, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский клинический институт (МОНИКИ) им. М. Ф. Владимирского», Москва.

Киселев Сергей Львович — профессор,доктор биологических наук, заведующий отделом эпигенетики в Федеральном бюджетном государственном учреждении науки «Институт общей генетики им. Вавилова РАН», Москва.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства Здравоохранения РФ, Москва.

Защита диссертации состоится «¿-Д » А 2014 г. в 1’

часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru.

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного

профессор,

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акутуальность темы

Недавно было обнаружено, что в клетках если не всех, то многих злокачественных опухолей происходит активация группы генов, которые в норме экспрессируются только в семенниках. В связи с тем, что их экспрессия характерна как для опухолей, так и для семенников, белковые продукты этих генов, определяющие в значительной степени иммуногенные свойства тех клеток, в которых они присутствуют, называют раково-тестикулярными антигенами (РТА, от английского cancer-testis antigens, CT-antigens).

Исследования последних лет показали, что экспрессия РТА является универсальной особенностью малигнизированных клеток различного происхождения, и это несмотря на то, что опухолевые клетки демонстрируют значительное разнообразие на уровне генетических изменений, которые лежат в основе пусковых молекулярных механизмов злокачественной трансформации. Каков бы ни был исходный генетический дефект, запускающий программу злокачественного перерождения, одним из необходимых условий трансформации является приобретение опухолевой клеткой некоторых черт, характерных для клеток репродуктивной системы, зависящих от способности экспрессировать РТА.

В процессе созревания половые клетки проходят несколько последовательных этапов, которые различаются между собой наборами активных тестикулярных генов. В клетках злокачественных опухолей экспрессируются отдельные представители РТА в различных сочетаниях, причем при переходе опухоли в более агрессивную форму может происходить ингибирование одних и активация других генов этой группы. Кроме того, экспрессия некоторых РТА чаще выявляется при более агрессивных, а других -при менее агрессивных видах злокачественных опухолевых заболеваний. Например, активация генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и FRAME, принадлежащих группе раково-тестикулярных генов (РТГ), кодирующих РТА, была описана разными авторами в опухолях гематологического происхождения, при этом характер экспрессии этих генов был различен в острых и хронических формах гемобластозов. Это позволяет высказать предположение о том, что, во-первых, в половых клетках осуществляется эшелонированная программа последовательной активации и инактивации генов РТА, а во-вторых, вполне вероятно, что в клетках злокачественных опухолей гены РТА также могут активироваться не случайным образом, но в сочетаниях, которые соответствуют определенному этапу созревания половых клеток. Кроме того, вполне вероятно, что агрессивность злокачественной опухоли может зависеть, помимо прочих факторов, от набора

РТА генов, которые в клетках данной опухоли экспрессируются. Мы предполагаем, что активность SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и FRAME относится к различным этапам программы созревания половых клеток, поэтому эти гены могут по-разному определять клинические проявления SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и FRAME- позитивных или негативных гемобластозов.

Сведений об экспрессии РТГ, представленных в научной литературе, в настоящее время недостаточно для полного понимания того, каким образом раково-тестикулярные антигены могут определять клиническое разнообразие злокачественных опухолей. Для прояснения этого вопроса необходимы дополнительные исследования распространенности экспрессии РТГ в злокачественных опухолях различного генеза и степени агрессивности, в том числе генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и FRAME.

Раково-тестикулярные антигены рассматриваются в качестве весьма перспективных мишеней для приложения иммунологических подходов для проведения противоопухолевой терапии. У некоторых пациентов, страдающих злокачественными опухолевыми заболеваниями, иммунный ответ на эти антигены возникает естественным образом. В этом случае опухолевые клетки подвергаются иммунной атаке и уничтожаются. Но далеко не всегда срабатывают естественные механизмы презентации раково-тестикулярных антигенов иммунокомпетентным клеткам, поэтому у многих больных специфическая противоопухолевая иммунная реакция при обычных условиях не развивается. Существуют данные о том, что противоопухолевый ответ можно значительно усилить при использовании различных схем введения пациентам пептидов, синтезированных на основе РТА-последовательностей, либо РТА, выделенных из опухолевых клеток. В связи с этим весьма актуальной является задача изучения особенностей распространения РТА для выявления среди них наиболее перспективных мишеней для проведения противоопухолевой иммунотерапии.

Поводом для проведения настоящей работы послужила высокая актуальность вопроса о фундаментальной роли раково-тестикулярных антигенов в проявлении клинических свойств злокачественных опухолевых заболеваний, а также перспективность РТА в качестве мишеней для иммунотерапии опухолей.

Цель исследования

изучение особенностей экспрессии раково-тестикулярных генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME при различных онкогематологических заболеваниях.

Задачи исследования

1. Исследовать профиль экспрессии генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLPI, SPANXA1, SSX1 й FRAME у пациентов с опухолевыми заболеваниями кроветворной системы.

2. Оценить связь профиля экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME с клиническими особенностями гемобластозов.

3. Охарактеризовать профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-I, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клеточных линиях К562, WI-38, mel Р, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor.

4. Оценить возможность использования экспрессии данных генов в качестве диагностических маркеров и индикаторов различных стадий эволюции онкогематологических заболеваний.

Научная новизна работы

Получены данные о распространении экспрессирующихся генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLPI, SPANXÄl, SSX1 и PRAME при различных онкогематологических заболеваниях. Показана зависимость клинических проявлений гемобластозов от экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME. Обнаружены различия в профилях экспрессии РТА генов между хроническими и острыми формами онкогематологических заболеваний. Кроме того, показаны различия в профилях экспрессии ранних и поздних стадий хронического миелоидного лейкоза, у первичных больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями, лимфогранулематозом, фолликулярной лимфомом, диффузной В-крупноклеточной лимфомой, и острого промиелоцитарного лейкоза. Продемонстрирована возможность проведения мониторинга гемобластозов с использованием количественной оценки уровня экспрессии данных генов методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени. Исследован профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMGl, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клеточных линиях K562, U-937, NOMO-1, THP1, WI-38, mel P, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor.

Научно-практическое значение

На основе метода ПЦР в реальном времени разработаны тест-системы для количественной оценки экспрессии генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEAl, PASDI, SCP1, SEMGl, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME в опухолевых клетках. Показана возможность использования данных тест-систем для определения спектра и интенсивности экспрессии генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEAl, PASDI, SCP1, SEMGl, SLLPI, SPANXA1, SSX1 и PRAME при различных опухолевых заболеваниях кроветворной и лимфоидной ткани с

5

целью выявления клинически значимых вариантов в пределах определенных нозологических форм. Кроме того, данные тест-системы могут применяться для определения уровня опухолевой нагрузки в дебюте заболевания и затем для проведения количественного мониторинга остаточных опухолевых клеток (для определения МОБ — минимальной остаточной болезни), позволяющего судить об эффективности терапии и стабильности ответа, а также для своевременного вывления молекулярного рецидива. Выявление спектра экспрессии генов SP 17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в первичной опухоли, а также контроль изменения профиля экспрессии этих генов в процессе опухолевой прогрессии, является предпосылкой для последующей разработки индивидуализированных иммунотерапевтических подходов, направленных на подавление роста опухолевых клеток, экспрессирующих тот или иной из перечисленных РТГ. Данные тест-системы могут быть использованы с диагностической целью в различных онкологических и онкогематологических клиниках.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведён поиск тематических публикаций среди отечественной и зарубежной литературы, разработан дизайн эксперимента, набрана коллекция клинических образцов и изучена первичная клиническая документация. Автор самостоятельно провёл статистический анализ полученных результатов и их интерпретацию. Все публикации по теме диссертации написаны автором самостоятельно.

Соответсвие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 — «онкология», конкретно пунктам 2 и 3.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Степень агрессивности опухолей связана с изменением профиля экспрессии раково-тестикулярных генов. Более агрессивные опухолевые клетки экспрессируют более широкий спектр PIT, каждый из которых имеет повышенный уровень экспрессии.

2. Хронические миелопролиферативные заболевания и хронический миелолейкоз в хронической стадии имеют близкий профиль экспрессии РТГ.

3. Фаза акселерации и бласшый криз хронического миеловдного лейкоза отличаются от хронической фазы активацией большего числа РТГ.

4. Онкомаркер PRAME экспрессируется в 100% случаев первичного острого промиелоцитарного лейкоза. Высокая экспрессия этого гена в дебюте ОПЛ — фактор благоприятного, а низкая экспрессия — фактор неблагоприятного прогноза.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состаялась 14 февраля 2014 г. на совместной научной конференции ‘ лаборатории экспериментальной химиотерапии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории рекомбинантных опухолевых антигенов, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, лаборатории медицинской биотехнологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Материалы дссертационной работы доложены на двух российских конференциях (X Всероссийской научно-практической конференции «Противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике» Москва, 20-21 марта 2014 г.; «II конгресс гематологов России», Москва, 17-19 апреля 2014 года) и двух международных конференциях (18th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, June 13-16, 2013; 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, June 12-15,2014., где один из тезисов был отмечен премией «travel grant»).

Публикации по теме диссертации

Материлы диссертации изложены в 14 работах, в том числе в 4 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 213 источников. Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного текста и включают 3 рисунта, 8 таблиц и 9 диаграмм.

Материалы и методы исследования

Клеточные линии. В данной работе профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME был исследован в клеточных линиях К562, WI-38, mel Р, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor.

Культивирование клеточных линий проводилось при 37°С в С02-инкубаторе в среде RPMI 1640, содержащей 10% телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES и 100 мкг/мл ампициллина. Контроль числа клеток при подсчёте живых и мёртвых клеток в камере Гаряева после их окраски трипановым синим. Для дальнейшей работы с мРНК отбирались не менее 10 клеток каждой культуры.

Исследованные больные. В процессе работы были отобраны пробы крови, костного мозга и лимфатических узлов больных, страдающих от хронических и острых форм различных онкогематологических заболеваний. Среди них были больные с диагнозом: эритремия (п=22), эссенциальная тромбоцитемия (17),

7

хронический миелоидный лейкоз (XMJI) (95), острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ) (п=90), диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) (п=17), лимфома Ходжкина (ЛХ) (п=27) и фолликулярная лимфома (ФЛ) (п=22).

Общее количество больных составило 290, причём от некоторых из них материалы для исследования были получены как в дебюте заболевания, так и после достижения ремиссии или при прохождении мониторинга заболевания.

Для создания контрольной группы -была отобрана кровь 15 здоровых доноров.

30 больных с диагнозом острый промиелоцитарный лейкоз наблюдались нами с момента первичной постановки диагноза, оставшиеся 60 в момент начала работы уже находились в состоянии клинической ремиссии. Лечение всех пациентов проводилось согласно протоколу итальянских авторов AIDA.

Выделение РНК и синтез кДНК. Тотальная РНК из образцов крови и костного мозга была выделена при помощи набора реактивов «RNA-экстракт-1 » (ООО «ГеноТехнология», Россия). Этот же набор использовался для получения кДНК. Вся работа проводилось в полном согласии с инструкцией, предложенной разработчиком.

Постановка реакции обратной транскрипции. Проведение реакции количественной ПЦР проходило с использованием наборов реактивов «Онкоскрин-2-lQ», «Онкоскрин-2-20», «Онкоскрин-9<3» и «Онкоскрин-140» (ООО «ГеноТехнология», Россия) для определения уровней экспрессии генов PML/RARa изотипа bcrl, PML/RARa изотипа ЬсгЗ, PRAME и контрольного гена ABL соответственно. Для определения уровня экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1 использовался 2-кратный буфер для ПЦР в реальном времени (ООО «ГеноТехнология», Россия). Системы праймеров и зондов для оценки уровня экспрессии GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SPÄNXA1 и SSX1 были разработаны на основании данных по геномным последовательностям, предоставленным on-line ресурсом http://bIast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Синтез специфических праймеров и зондов был заказан в компании «ДНК-технология», Россия.

Статистический анализ данных. Для таких параметров, как пол, возраст, длительность заболевания и терапии, а так же измеренный уровень экспрессии гена, представлено вычисление медианного значения и интерквантильных интервалов. Анализ времени развития рецидива проводился по методу Каплан-Мейера. Для сравнения групп больных по профилям экспрессии РТГ, времени безрецидивной выживаемости и срока достижения ремиссии применялся критерий

Сравнение групп больных с разным диагнозом по такому признаку, как уровень экспрессии конкретного генов, применялся критерий Манна-Уитни. Критерий выбран в связи с тем, что в составе большинства групп было рассмотрено сопоставимое количество случаев. Результаты признавали статистически достоверными на уровне р < 0,05.

Все расчёты проводились в программе Statistica 8.0.

8

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ Особенности активности раково-тестикулярных генов в клеточных линиях К562, \VI-38 и семи линий меланомы. Каждая рассмотренная нами линия клеток обладала уникальным набором активных генов, кодирующих РТА.

В частности, в линии К562 (диагр. 1) экспрессировались все исследуемые РТГ. Поскольку данная линия является моделью властного криза ХМЛ, то не исключено, что при исследовании свежего материала, полученного от больных с данным диагнозом, можно будет наблюдать сходный профиль экспрессии РТГ.

10000%

1000%

100%

10%

1%

0%

Диаграмма 1. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры К562.

При этом, в клетках линии WI-38, являющейся моделью ткани лёгкого человеческого зародыша, экспорессируется меньше генов, и наблюдается меньший уровень их активности (диагр 2.). Данный результат продемонстрировал прежде всего работоспособность экспериментальной системы. Кроме того, наблюдение экспрессии генов не противоречит мировым данным о том, что активность РТГ характерна и для эмбриональных тканей.

Опубликованы данные, согласно которым уровень экспрессии генов, кодирующих РТА, коррелирует со степенью дифференцировки клеточной культуры, что возможно, связано с частотой митозов. Согласно данным И.Н. Михайловой и др., к низкодифференцированным морфологическим формам относятся линии mel Kor, mel Ibr и mel Mtp (диагр. 9, 8, 5). К умереннодифференцированным линиям относятся mel IL, mel Р и mel Нп (диагр. 6, 3, 7). Наконец, линия клеток mel Si классифицирована как высокодифференцированная культура (диагр. 4).

10000%

Диаграмма 2. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры \У138.

Высокий уровень экспрессии генов оказался характерным для двух низкодифференцированных и двух умереннодифференцированных линий. В то же время более низкий уровень экспрессии РТГ выявлен у низко-, умеренно- и высокодифференцированных линий. Следует отметить, что разделение на три группы по признаку уровня экспрессии и частоты активации РТГ оказался невозможным в силу статистической недостоверности полученных результатов.

‘ му / «

Диаграмма 3. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры ше1 Р.

ю

Диаграмма 4. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Si

Диаграмма 5. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Mtp.

Диаграмма 6. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel IL.

10000%

Диаграмма 7. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Нп.

Диаграмма 8. Профиль экспрессии PIT в клетках культуры mel Ibr.

Диаграмма 9. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры те1 Ког.

Таким образом, мы получили данные о том, что для низкодифференцированных клеток меланомы характерен как высокий, так и более низкий уровень экспрессии РТГ. При этом у высокодифференцированной линии обнаружен достоверно более низкий уровень экспрессии РТГ, чем у низкодифференцированных линий.

Экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 у здоровых доноров и больных, страдающих от онкогематологических заболеваний. Два

раково-тестикулярных гена, HAGE и SLLP1, экспрессировались в клетках крови у всех 15 здоровых доноров (таблица 1). При этом никто из группы здоровых доноров не демонстрировал признаков онкогематологического заболевания. Можно сделать вывод о том, что экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 действительно характерна для генетически нормальных ядерных клеток, циркулирующих в кровеносной системе здорового человека.

Таблица 1. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови у здоровых доноров и у больных в дебюте хронических миелоприлиферативных заболеваний (хМПЗ) и хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ ХФ, без лечения).

♦Здесь н далее в: уровень экспрессии гена указан в % отностительно уровня экспрессии гена ABL.

Диагноз Здоровые доноры хМПЗ ХМЛ, ХФ, без лечения

Характеристика больных Количество больных, п 15 39 11

Из них мужчин, п (%) 7; (54%) 11; (27%) 7; (64%)

Возраст, годы, медиана (диапазон) 25; (19-45) 55; (31-79) 43; (36-65)

Гены SP 17 Ч%) — — -

GAGE! — — -

HAGE П(,%) 15 (100%) 2,92% 25 (63,4%) 1,67% 4 (36,4%) 1,41%

m-Eso-i n(;/o) — — -

MAGEAl n(J/o) — — -

SCP1 — — -

SEMGl П(,%) — — -

SLLP1 15; (100%) 0,62% 32 (80,5%) 0,12% 4 (36,4%) 0,15%

SPANXA1 П(„%) — — -

от n(;/o) — — -

FRAME n(;/o) — 4; (10%) 0,5; (0,1-13) 1;(9%) 5,5

Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках крови у больных в дебюте XMJI и Ph’-негативных хМПЗ. Предварительно у больных с диагнозом эритремия и эссенциальная тромбоцитемия была определена мутация JAK2V617F. Материалы, полученные от первичных больных с диагнозом хронический миелоидный лейкоз, были проверены на наличие экспрессии химерного гена BCR-ABL. Материалы, в которых не было выявлено мутация JAK2V617F или отсутствовал транскрипт гена BCR-ABL, из дальнейшего исследования были исключены. У двух первичных больных с диагнозом эритремия и двух больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия мы наблюдали спонтанную экспрессию ещё одного РТГ — PRAME. Поскольку эритремия и эссенциальная тромбоцитемия, согласно современным представлениям, отнесены к так называемым Ph’-негативным хроническим миелопролиферативным заболеваниям (хМПЗ), в дальнейшем анализе они рассмотрены как одна группа (таблица 1).

Профили экспрессии РТГ в клетках крови у больных со впервые диагностированными хМПЗ и ХФ ХМЛ не отличаются друг от друга (р=0,199). Только у единичных представителей этих групп экспрессирутеся ген PRAME, причём на сопоставимом уровне относительно контрольного гена (р=0,001). Активность других рассматриваемых РТГ не выявлена.

Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом. У одного из 11 больных, находящихся в хронической фазе (ХФ) ХМЛ и получающих специфическую терапию, в крови обнаружена экспрессия гена SPANXA1. Ген PRAME экспрессировался с одинаковой частотой как у леченых, так и нелеченных больных (р=0,346).

В крови больных, находящихся в фазе акселерации (ФА) и бластном кризе (БК) ХМЛ, экспрессируется больше генов, чем при ХФ (достоверность отличий р=0,032 и р=0,048, соответственно). В частности, при ФА, кроме экспрессии SPANXA1 и PRAME, наблюдалась активность генов GAGE1, MAGEA1, SEMG1 и SSX1. При БК экспрессировались гены GAGE1, SEMG1, SSX1 и PRAME.

В крови пациентов, получающих лечение Иматинибом, отмечено увеличение уровня экспрессии PRAME в БК относительно ХФ (р=0,001) и ФА (р=0,048) (таб. 2).

В костном мозге больных в дебюте заболевания ХМЛ не обнаружено экспрессии каких-либо РТГ. Однако у леченных больных, находящихся в ХФ ХМЛ в костном мозге в единичных случаях экспрессируются гены NY-ESO-1 и SCP1, в ФА экспрессировались гены SEMG и SSX1, и в БК — GAGEL

Только один ген PRAME экспрессировался в клетках костного мозга леченных больных с диагнозом ХФ, ФА и БК ХМЛ. Наблюдаемые значения уровня экспрессии у больных в стадии БК были выше, чем при ХФ (р=0,06) и при ФА (р=0,026) (таб. 3).

Таблица 2. экспрессия PIT в крови больных хроническим миелоидньш лейкозом.

ХМЛ,ХФ ХМЛ, ФА ХМЛ, БК

а М Количество больных, п 11 27 ‘ 21

а о ю Из них мужчин, п (%) 7; (64%) 10; (37%) 9; (43%)

¡5 О Возраст, годы, медиана (диапазон) 43; (36-65) 50; (23-66) 51; (27-78)

Он ё Длительность заболевания, мес., медиана (диапазон) — 66; (11-195) 57; (12-168)

X Терапия Гливеком, мес., медиана (диапазон) — 61; (10-74) 53;(13-81)

GAGE1 п(%) * — — 4; (19%) 0,3; (0,1-18)

NY-ESO-1 П(%) * — — -

MAGEA1 п(%) * — — 1; (5%) 0,01

? SCP1 п(%) * — — -

О 1-1 SEMG1 п(%) * — — 5; (27%) 0,7; (0,3-1,3)

SPANXA1 п(%) * — 1; (4%) 0,15 1; (5%) 0,01

SSX1 п(%) * — — 3; (14%) 0,3; (0,1-0,4)

PRAME п(%) * i;(9%) 5,5 2; (7%) 43; (38-48) 6; (28%) 3; (0,3-51)

Таблица 3. Экспрессия РТГ в костном мозге больных ХМЛ.

ХМЛ.ХФ, без лечения ХМЛ,ХФ ХМЛ, ФА ХМЛ, БК

Количество больных, п 5 10 6 5

£ о ко Из них мужчин, п (%) 3; (60%) 6; (60%) 4; (67%) 3; (60%)

и Е о Возраст, годы, медиана (диапазон) 62; (33-77) 56; (23-81) 46; (32-50) 53; (36-65)

& и Длительность заболевания, мес., медиана (диапазон) — 5В; (14-156) 63; (29-110) 69; (14-204)

& X Терапия Гливеком, мес., медиана (диапазон) — 55; (1295) 44; (9-50) 59; (9103)

<24 п(%) * — — — 1; (20%) 0,1

п(%) * — 1; (10%) 35,36

ШвЕА1 П(%) * — » ; _

БСР1 П(%) * — 1; (Ю%) 0,14 ~

5ЕМЫ п(%) * — — 2; (33%) 0,5(0,15-1)

ЯРАЮСА! п(%) * — — _

55X2 п(%) * — — 1; (17%) ,03

РЯАМЕ п(%) * 3; (30%) 27; (21-51) 5; (83%) 0,2; (0,1-3,) 4; (80%) 36; (7-81)

Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных острым промиелоцЕтарным лейкозом. В костном мозге у каждого из 30 пациентов ОПЛ, ещё не получивших специфического лечения, были обнаружены транскрипты химерного гена PML/RARa и мРНК гена PRAME (рис. 1). Среднемедианный уровень экспрессии PRAME для больных, имеющих перестройку в точке bcrl, составил 2,9% (при наблюдаемых значениях от 0,001% до 200%). Для пациентов с перестройкой ЬсгЗ медиана уровня экспрессии гена PRAME составила 48,4% (разброс значений от 0,5% до 460%). Ни одна проба клеток костного мозга, полученная от пациентов в дебюте заболевания, не содержала мРНК генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD. SCP1, SEMG1 SPANXA1 и SSX1. Начиная с момента установки диагноза, в течение 18 месяцев проводилось наблюдение за больными. На основании соотношения уровней экспрессии генов PRAME и изотипов bcrl и ЬсгЗ PML-RARa выделено две группы пациентов: субгруппы с низким и высоким показателем экспрессии гена PRAME (PRAME/PML-RARa < > 0,05) (р=0,003). В качестве граничного значения мы выбрали уровень соотношения равным 0,05, и разделили всех пациентов на четыре субгруппы (рис. 1). При этом у больных, до начала специфической терапии имеющих очень низкий уровень экспрессии гена PRAME относительно PML/RARa, с высокой частотой наблюдалось развитие раннего рецидива (рис 2.).

PRAME I PML-RARa (bert >

PRAME I PML-RARa (Ьс?3)

550%

— зоо%

о 450%

ъ «Юй

350%

5 300%

X 250%

1 200%

§■ 150»

ё 100%

1 50%

5 О

Я»

275% 250% 225% 200SS 175» 150% 125% 100% 75% 50% 25% 0

I

Уровень зксфесснк PML-RARc.

Уровень эксгресаш PRAME.

Рис. 1. Наблюдаемые соотношения уровней экспрессии гена PRAME и транскриптов гена PML/RARa.

Таким образом, низкий уровень экспрессии PRAME является неблагоприятным признаком у первичных ЬсгЗ-положительных больных ОПЛ.

Транскриггг bcrl

Транскрипт ЬсгЗ

OiS -0,60,40,2 -

PRAME/P-Ra(bai)>0,05;n=4

In-i

PRAME/P-RCI(bCrl) < 0,05; n = 12

1,00,80,60,40,20

—,_.

PRAME/P-Ra(bcr3) >0,05

PRAME/P-Ra(bcr3) <0,

:0,05 n=6 •

3 6 9 12 15 1« 21 Месяцы

9

Месяцы

1 I i Г 12 15 18 21

Рис. 2. Время выживаемости без рецидива у больных ОПЛ в зависимости от соотношения между уровнем экспрессии генов FRAME и изотипов bcrl и ЬсгЗ PML-RARa.

Таблица 4. Профиль экспрессии РТГ у первичных больных с диагнозом диффузная В-крупноклеточная лимфома.

§ Исследованный материал Кровь Костный мозг

11 Количество больных, п 17 12

s а у С Й 10 Из них мужчин, п (%) 7; (41%) 5; (42)

8-X Возраст, годы, медиана (диапазон) 52; (21-77) 50 (21-75)

GAGE1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 3; (17%) 2,52% 2; (16%) 1,36

HAGE Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 13; (76%) 1,67% 11; (96%) 2,86 %

NY-ESO-1 Обнаружен в труппе, п (%) Уровень экспрессии* 1; (6%) 1,1 % .

SCP1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* » 1; (8,4%) 0,04%

Гены SEMG1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 4; (24%) 3,55% 2; (16%) 19%

SLLP1 Обнаружен в группе, п (%) Урозень экспрессии* 8; (47%) 0,78% 6; (50%) 0,33%

SPANXA1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* ‘ 3; (25%) 0,29%

SSX1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 3; (18%) 0,064% «

PJRAME Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 1; (6%) 65% 2; (16%) 4,56%

Прогностическая значимось уровня экспрессии гена HAGE в дебюте диффузной В-крупноклеточной лпмфомы. Были изученны данные о таких исходах лечения, как достижение полной ремиссии, что классифицировано нами, как благоприятный исход, и достижение частичной ремиссии, либо смерть больного во время проведения курса лечения, что рассматривалось как неблагоприятный исход.

Связи профиля экспрессии РТГ в крови больных в момент постановки диагноза на успех проведенной терапии не было обнаружено.

Единственным признаком, связанным с исходом заболевания, является уровень экспрессии гена HAGE. Так, неблаговриятный исход наблюдался у больных, имеющих относительно высокий уровень экспрессии РТГ HAGE в клетках костного мозга. Среднемедианный уровень экспрессии у таких больных (п=7) составляет 10,9% относительно уровня экспрессии гена АЫ. У больных, благополучно достигших полной ремиссии (п=5), уровень экспрессии РТГ HAGE в клетках костного мозга составлял только 0.69%, достоверность различий была определена по критерию Манну-Уитни (р=0,093). Этот параметр оказался независимым от возраста и проводимой терапии.

Таким образом, мы показали, что высокий уровень экспрессии гена HAGE в костном мозге больных со впервые установленным диагнозом диффузная В-крупноклеточная лимфома связан с меньшей эффективностью терапии.

Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом лимфома Ходжкина. Всего исследовано 27 человек, среди которых было 15 женщин и 12 мужчин. Медиана возраста составляет 36 лет. От всех больных перед началом лечения были отобраны лимфатические узлы, и образцы периферической крови. Все больные получали терапию согласно протоколу R-ВЕАСОРР-14.

В образцах крови, так же, как и в лимфоузлах, полученных от тех же больных, наблюдалась экспрессия GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, но при этом ни в одном случае не экспрессировался ген MAGEA1. Так же, как в лимфатических узлах, уровни экспрессии были различны, и наблюдались разннобразные сочетания экспрессирующихся РТГ. При этом у одного больного в клетках крови ко-экспрессировалось семь генов (табл. s 3 Количество больных, п 27 27

И Ц S о id VO в- Из них мужчин, п (%) 12; (44%) 12; (44%)

Й Возраст, годы, медиана (диапазон) 36; (19-72) 36; (19-72)

GAGE1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 2; (7%) 1% 2; (7%) 1,2%

HAGE Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 24; (88%) 4,68% 26; (96%) 2,64 %

NY-ESO-1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 6; (22%) 0,2 % 6; (22%) 6,4 %

MAGEA1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* — 2; (7%) 62%

PASD Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 2; (7%) 0,25% 4; (15%) 0,7%

Гены SCP1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* — 1; (8,4%) 0,12%

SEMG1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 12; (44%) 11% 5; (27%) 2,3%

SLLP1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 13; (48%) 0,66% 12; (44%) 0,74 %

SPANXA1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 3; (11%) 1,7% 4; (15%) 2,45%

SSX1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 6; (22%) 0,1% 2; (7%) 20%

PRAME Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 4; (15%) 0,06% 17; (63%) 12,2%

У шестерых больных, после проведения шести курсов химиотерапии, была достигнута полная ремиссия, при которой мы не обнаружили экспрессии РТГ, наблюдаемых до проведения терапии. Таким образом, нам удалось сделать независимое подтверждение элиминации трансформированных клеток у этих больных.

Седьмой больной достиг полной ремиссии после четырёх проведённых курсов полихимиотерапии. В дебюте у этого больного в крови наблюдалась экспрессия гена HAGE на уровне 1,9% относительно гена АЫ (что на 30% выше уровня, характерного для здоровых доноров), и гена NY-ESO-1 на уровне 0,012% относительно АЫ. После диагностирования ремиссии в крови этого больного экспрессировались гены SEMG1, SSX1 и PRAME (их уровни составляли 0,05%,

21

566% и 0,03% относительно АЫ, соответственно), и не наблюдалась экспрессия генов HAGE и SLLP1. Таким образом, несмотря на достигнутую гематологическую ремиссию, профиль экспрессии РТГ в крови больного остался не похожим на профиль экспрессии, наблюдаемый в крови здорового донора.

Экспрессия раксво-тестикулярных генов у больных с диагнозом фолликулярная лимфома. В образцах костного мозга, так же, как и в лимфоузлах, полученных от тех же больных, наблюдалась экспрессия GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, но при этом ни в одном случае не экспрессировался ген MAGEA1 (таблица 6).

Таблица 6. Экспрессия РТГ у первичных больных с диагнозом фолликулярная лимфома.__

S э Исследованный материал Кровь Костный мозг Лимф, узел

В Й s ¡S й- 5 Количество больных, п 22 22 22

§ 3 Из них мужчин, п (%) 10; (45%) 10; (45%) 10; (45%)

§* X Возраст, годы, медиана (диапазон) 57; (38-75) 57; (38-75) 57; (38-75)

GAGE1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 2; (9%) 1,4% — 4; (18%) 0,4%

HAGE Обнаружен в труппе, п (%) Уровень экспрессии* 22; (100%) 3,7% 20; (90%) 2,3% 19; (86%) 1,4%

NY-ESO-1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 2; (9%) 1,6% 2; (9%) 1,4% -

MAGEA1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* — — 1; (4,5%) 250%

PASD Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* — 1;(4,5%) 0,02% -

Гены SCP1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 1; (4,5%) 28% 3; (13%) 0,27% 3; (13%) 0,4%

SEMG1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 9; (40%) 14% 7; (32%) 11% 8; (36%) 8,4%

SLLP1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 13; (59%) 0,24% 4; (18%) 0,7% 6; (27%) 0,11%

SPANXA1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* — 5; (23%) 1,7% 7; (32%) 0,15%

SSX1 Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 1; (4,5%) 0,02% 3; (13%) 0,07% -

PRAME Обнаружен в группе, п (%) Уровень экспрессии* 3; (13%) 0,6% 10; (45%) 0,45% 14; (64%) 8%

Мы выяснили, что при фолликулярной лимфоме прогностическое значение имеет экспрессия гена FRAME в образцах лимфатических узлов, поражённых заболеванием. Высокий уровень экспрессии РТГ в дебюте заболевания в

дальнейшем сопровождался меньшей эффективностью применяемой терапии. Установлена связь экспрессии гена PRAME в клетках поражённых лимфатических узлов с ответом на терапию. При уровне экспрессии гена FRAME в лифматических узлах на уровне ниже 6% относительно гена АЫ, в основном отмечался хороший клинический ответ, и достигалась полная ремиссия (р=0,0041, согласно критерию Манна-Уитни).

Для экспрессии остальных исследованных генов удалось установить только диагностическое значение. При диагностике клинической ремиссии в клетках крови больных мы наблюдали экспрессию гена HAGE, и не детектировали экспрессию других генов. У этих же больных до начала терапии в исследованных образцах наблюдалась активность генов GAGE], SEMG1, и FRAME. Таким образом, если до лечения в крови больных находились клетки, экспрессирующие данные гены, то после достижения ремиссии, подтверждённой клиницистами, мы показали исчезновение этих клеток.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены различия в профилях экспрессии генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 ъ PRAME в клеточных линиях К562, WI-38, mel Р, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor.

2. Обнаружены существенные различия профилей экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME между разными видами гемобластозов, при этом опухолевая прогрессия сопровождается увеличением числа и интенсивности экспрессии данных генов.

3. Низкий уровень экспрессии гена FRAME в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза увеличивает вероятность раннего развития рецидива (р=0,0231).

4. Активация экспрессии генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX, a также усиление уровня экспрессии PRAME происходит при прогрессии хронического миелолейкоза и при переходе этого заболевания из хроничекой фазы в фазу акселерации (р=0,032) и бластного криза (р=0,048).

5. Неблагоприятным фактором диффузной В-крупноклеточной лимфомы является гиперэкспрессия гена HAGE в клетках костного мозга в дебюте этого заболевания (р=0,093), арезистеностью фолликулярной лимфомы к проводимой химиотерапии (р=0,0041) сопроваждается гиперэкспрессией гена PRAME в лимфатических узлах.

6. Определение уровня экспрессии РТГ GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME можно использовать для мониторинга минимальной остаточной болезни гемобластозов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ

1. Мисюрин, В А. Профили экспрессии раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы / В А. Мисюрин, А.В. Мисюрин, А.Е. Лукина, А.А. Л.А. Кругов, Кесаева, И.В. Солдатова, Т.В. Ахлынина, Н.А. Лыжко, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, МЛ. Барышникова, А.Ю. Барышников // Биологические мембраны. — 2014. — Т.31. —№2. — С.104-109.

2. Мисюрин, В.А. Особенности соотношения уровней экспрессии генов PRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза / В.А. Мисюрин, А.Е. Лукина, А.В. Мисюрин, Л.А. Кесаева, Е.Н. Мисюрина, Ю.П. Финашугина, И.Н. Солдатова, А.А. Кругов, И.В. Санникова, М.Н. Ротанова, В.А. Лапин, О.А. Рукавицын, С.В. Шаманский, Н.К. Хуажева, В.Л. Иванова, Н.В. Архипова, Ю.А. Лесная, О.В. Шитова, Е.А. Борисенкова, Т.М. Толстокорая, Е.Н. Голубева, Н.А. Бычкова, Н.А. Вопшшна, И.И. Гущанская, Г.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — Т. 13. — №. 1. — С. 9-16.

3. Мисюрин, В.А. Новые маркеры прогрессирования хронического миелолейкоза / В .А. Мисюрин, А.В. Мисюрин, Л.А. Кесаева, Ю.П. Финашугина, Е.Н. Мисюрина, И.Н. Солдатова, А.А. Кругов, Н.А. Лыжко, Т.В. Ахлынина, А.Е. Лукина, Т.Н. Колошейнова, Н.В. Новицкая, Е.Г. Аршанская, Е.Г. Овсянникова, Р.А. Голубенко, В.А. Лапин, Т.И. Поспелова, В.А. Тумаков, А.Ю. Барышников // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. — 2014. — Т.7. — №2. — С.206-212.

4. Мисюрин, В.А. Х-хромосомные раково-тестикулярные гены / В .А. Мисюрин // Российский биотерапевтический журнал. —2014. — Т.13. —№2. — С.3-9.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ

1. Misyurin, V. Expression pattern of cancer-testis antigens SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESOl, MAGE1, PASD1, SCP, SEMG, SLLPI, SPANXA, SSX1 and PRAME in CML / V. Misyurin, A. Misyurin, A. Krutov, L. Kesaeva, I. Soldatova, E. Misyurina, A. Mastchan, S. Rumyantsev, A. Rumyantsev, A. Baryshnikov // Haematologica. 18th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, Sweden, June 13-16, 2013. Abstract book. Abstract B1400.

2. Misyurin, V. Comparison of the expression cancer-testes (CT) antigen profiles in CML and polycythemia vera (PV) / V. Misyurin, A. Misyurin, M. Sokolova, A. Krutov, L. Kesaeva, I. Soldatova, E. Misyurina, A. Mastchan, S. Rumyantsev, A. Rumyantsev, A. Baryshnikov // Haematologica. 18th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, Sweden, June 13-16,2013. Abstract book. Abstract B1567.

3. Misyurin, V. High expression level of PRAME gene is favorable prognostic factor in acute promyelocytic leukemia patients / V, Misyurin, A. Misyurin, L. Kesaeva, Y. Finashutina, I. Soldatova, A. Krutov, E. Misyurina, A. Lukina, I. Sannikova, M. Rotanova, V. Lapin, O. Rukavitsyn, S. Shamanskiy, N. Huazheva, V. Ivanova, N. Arhipova, Y. Lesnaya, O. Shitova, E. Borisenkova, T. Tolstokoraya, E. Golubeva, N. Bychkova, N. Vopilina, L Guschanskaya,

G. Mihaylova, A. Baryshnikov // Haematologica. 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, Italy, June 12-15,2014. Abstract book. Abstract P170.

4. Misyurin, V. An additional point to confirm a remission in Hodgkin’s lymphoma / V. Misyurin, A. Misyurin, A. Lukina, D. Marin, N. Sharkunov, Б. Dubrovin, L. Piastinina, S. Kravchenko, A. Baryshnikov // Haematologica. 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, Italy, June 12-15,2014. Abstract book. Abstract PB1755.

5. Misyurin, V. New molecular markers of CML progression / V. Misyurin, A. Misyurin, L. Kesaeva, Y. Finashutina, I. Soldatova, A. Krutov, E. Misyurina, N. Lyzhko, T. Akhlynina, A. Lukina, T. Kolosheinova, N. Novitskaya, E. Arshanskaya, E. Ovsyannikova, R. Golubenko, V. Lapin, T. Pospelova, A. Baryshnikov // Haematologica. 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, Italy, June 12-15,2014. Abstract book. Abstract P277.

6. Мисюрин, B.A. Особенности соотношения уровней экспрессии генов PRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза / В.А. Мисюрин, А.Е. Лукина, A.B. Мисюрин, Л.А. Кесаева, E.H. Мисюрина, Ю.П. Финашугина, И.Н. Солдатова, A.A. Кругов, А.Ю. Барышникоз // Материалы X Всероссийской научно-практической конференции «Противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике». Москва, 20-21 марта 2014 г. Российский биотерапевтический журнал. 2014, Т. 13, №1, С. 112.

7. Мисюрин, В.А. Различия в частоте развития рецидива острого промиелоцитарного лейкоза в зависимости от уровня экспрессии гена PRAME / В.А. Мисюрин, А.Е. Лукина, Л.А. Кесаева, A.B. Мисюрин, В.А. Лапин, O.A. Рукавицын, Н.В. Архипова, Е.А. Борисенкова, H.A. Вопшшна, И.И. Гущанская, А.Ю. Барышников // Материалы П конгресса гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014 года. Гематология и трансфузиология. 2014. Т1. приложение№1. С51.

8. Мисюрин, В.А. Сходство профилей экспрессии раково-тестикулярных генов при хронических миелопролиферативных заболеваниях и хроническом миелоидном лейкозе / В.А. Мисюрин, A.B. Мисюрин, Л.А. Кесаева, Ю.П. Финашугина, E.H. Мисюрина, И.Н. Солдатова, A.A. Кругов, H.A. Лыжко, Т.В. Ахлынина, А.Е. Лукина, А.Ю. Барышников // Материалы П конгресса гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014 года. Гематология и трансфузиология. 2014. Т1. приложение №1. С51.

9. Мисюрин, В.А. Изменение профиля экспрессии канцер-тестис генов в крови при прогрессии хронического миелоидного лейкоза / В.А. Мисюрин, A.B. Мисюрин, Л.А. Кесаева, Ю.П. Финашугина, E.H. Мисюрина, И.Н. Солдатова, A.A. Кругов, H.A. Лыжко, Т.В. Ахлынина, А.Е. Лукина, А.Ю. Барышников // Материалы II конгресса гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014 года. Гематология и трансфузиология. 2014. Т1. приложение №1. С52.

10. Мисюрин, В.А. Особенности экспрессии раково-тестикулярных генов в клетках костного мозга больных хроническим миелоидным лейкозом / В.А. Мисюрин, A.B. Мисюрин, Л.А. Кесаева, Ю.П. Финашугина, E.H. Мисюрина, И.Н. Солдатова, A.A. Кругов, H.A. Лыжко, Т.В. Ахлынина, А.Е. Лукина, А.Ю. Барышников // Материалы П конгресса гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014 года. Гематология и трансфузиология. 2014. Т1. приложение №1. С52.

Подписано в печать 19.09.14 Формат 60×84/16. Бумага офисная «БуеЬэСору». Тираж 100 экз. Заказ № 552 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Бпохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Экспрессию циркадных генов удобно определять в коже человека

Подготовила Елена Клещенко


Поскольку физиологический и биохимический статус организма человека изменяется в течение суток в соответствии с циркадным (околосуточным) циклом, выбирать идеальное время для приема того или иного препарата или хирургического вмешательства желательно с учетом циркадной фазы. Золотой стандарт для ее определения — измерение концентрации мелатонина в слюне или плазме крови в часы, предшествующие сну, при тусклом свете (dim-light melatonin onset, DLMO), однако это метод неудобный, дорогостоящий, и он трудно поддается стандартизации. Исследователи стремятся разработать другие методы, основанные на экспрессии генов (об одной такой работе см.
новость на PCR.ru).


Сотрудники Медицинского центра детской больницы в Цинциннати (Огайо, США) и компании Procter and Gamble идентифицировали маркеры экспрессии генов, соответствующие циркадной фазе, не в плазме крови, а в коже. То, что экспрессия генов в клетках кожи подчиняется циркадному ритму, было известно давно: это важно для защиты от ультрафиолетового излучения. Нарушения этих ритмов ассоциированы с псориазом и раком кожи. «Мы показали, что “часы” в человеческом эпидермисе более мощные, чем в крови, и разработали панель биомаркеров, которые позволяют фазировать индивида с точностью до трех часов по единственному образцу», — пишут авторы статьи в PNAS USA.


Исследователи брали образцы эпидермиса с предплечья у 20 человек (один позднее был исключен из исследования) каждые шесть часов в течение суток. Они обнаружили более ста генов, экспрессия которых закономерно изменялась; ритмы демонстрировали бимодальное распределение, с пиками утром и вечером. Эти результаты сравнили с литературными данными по экспрессии генов в коже мыши в фазах телогена и анагена (роста волосков и покоя) и выявили соответственно 1280 и 294 циркадных генов, с аналогичными бимодальными распределениями. Гены ARNTL, NPAS2, NR1D2, HLF и PER2 демонстрировали сходные шаблоны экспрессии во всех трех наборах данных; можно было предположить, что эти гены эволюционно консервативны.


Чтобы оценить вклад индивидуальных вариаций, авторы взяли образцы у 219 человек в разное время суток и сравнили экспрессию генов с результатами, полученными на меньшей выборке. Исследуя парные корреляции экспрессии генов, они отметили, что и в маленькой, и в большой выборках уровни экспрессии ARNTL, NPAS2 и CLOCK, положительно коррелировали друг с другом и отрицательно — с генами DBP, NR1D1 и PER3, что отражает функциональную связь их продуктов.


С помощью ранее созданного алгоритма CYCLOPS (cyclic ordering by periodic structure) авторы реконструировали циркадный транскриптом человеческой кожи. Исследование двух наборов образцов выявило 188 генов, которые ритмично экспрессируются в коже человека, и позволило реконструировать временный порядок взятия образцов.


Авторы работы впервые протестировали экспрессию 10 основных циркадных генов в коже и крови человека и разных тканях у мышей, и обнаружили, что самая сильная коэкспрессия этих генов на уровне популяции наблюдается в образцах эпидермиса.


Чтобы выбрать наилучшие биомаркеры, использовали еще один алгоритм, ZeitZeiger, обучив его на ранее полученных образцах, и обнаружили 29 кандидатных биомаркеров. Их испытали на выборке из еще девяти человек, у которых брали образцы кожи в разное время дня. Средняя прогнозируемая фаза отличалась от фактического времени взятия пробы не более чем на три часа.


Авторы отмечают, однако, что для различных областей циркадной медицины могут понадобиться и другие источники биомаркеров; чтобы сравнить возможности циркадных транскриптомов крови и кожи, нужны дополнительные исследования.


Источник


Gang Wu et al. // Population-level rhythms in human skin with implications for circadian medicine // PNAS published ahead of print October 30, 2018
DOI: 10.1073/pnas.1809442115


Статья на BioRxiv.org

Экспрессия сигнальных молекул в эндометрии человека | Мэлсмон

И.М. Кветной, доктор медицинских наук, профессор, Т.С. Клейменова, В.Р. Родичкина, А.О. Дробинцева, кандидат биологических наук, доцент, В.О. Полякова, доктор биологических наук, профессор, А.А. Цыпурдеева, кандидат медицинских наук, М.Р. Оразов, доктор медицинских наук, доцент, С.Р. Поликарпова

Введение. Статья посвящена актуальной медико-социальной проблеме современной репродуктивной медицины – разработке подходов к повышению и восстановлению имплантационной восприимчивости эндометрия при бесплодии. Помимо традиционной гормональной терапии, современная медицина располагает широким комплексом метаболических веществ, антиоксидантов и репарантов для оптимизации рецептивности эндометрия. Исследование проводилось на культуре клеток эндометрия пациенток разного репродуктивного возраста с бесплодием, так как в современном мире с улучшением качества жизни и медицинскими достижениями все больше женщин планируют беременность после 35 лет.

Цель исследования. In vitro оценивалось влияние гидролизата плаценты человека для подкожного применения (препарат Мэлсмон®, Япония) на экспрессию сигнальных молекул, обеспечивающих рецептивность эндометрия к имплантации. Результаты. Выявлено статистически достоверное увеличение экспрессии маркеров кальретикулина, кисспептина и сиртуина-1, тогда как содержание цитохрома ароматазы Р450 понижалось в культурах эндометрия пациенток с бесплодием под воздействием препарата Мэлсмон.

Заключение. Проведенные исследования экспрессии ключевых сигнальных молекул, обеспечивающих регуляцию метаболических процессов, внутри- и межклеточные взаимодействия в тканях, показали, что препарат Мэлсмон обладает свойствами регулировать и оптимизировать состояние эндометрия, восстанавливая его структурно-функциональные характеристики, активируя процессы внутри- и межклеточных коммуникаций, способствующие повышению имплантационной способности эндометрия.

Ключевые слова: препарат Мэлсмон, эндометрий, имплантация, рецептивность, бесплодие, сигнальные молекулы.

ВВЕДЕНИЕ

Бесплодный брак остается одной из важных медицинских, социальных, экономических и демографических проблем. По данным ВОЗ, его частота составляет 10–15% и не имеет тенденции к снижению. Данные мировой статистики коррелируют с показателями по России [1]. При этом в структуре женского бесплодия патология эндометрия составляет 24–62% [2], а частота патологических изменений эндометрия при бесплодии, по данным российских авторов, приближается к 88% [3].

Недостаточная эффективность методов восстановления естественной фертильности человека стимулировала развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), результативность которого колеблется в среднем от 28,5 до 32,5% [4, 5] и в настоящее время не превышает 50%.

Основные проблемы, влияющие на результат ВРТ, – это качество эмбрионов (женский фактор – состояние «овариального резерва») и качество эндометрия (его потенциал имплантации). Так, при наличии хронического эндометрита и его последствий эффективность ВРТ снижается до 32–35%, не достигая 40% даже после лечения. А при синдроме «тонкого» эндометрия (<7 мм в период окна имплантации) частота наступления беременности при ВРТ составляет всего 8,5–10,8% [6].

Недостаточная эффективность ВРТ стимулировала в последние годы повышение внимания исследователей к разработке методов, направленных на повышение результативности циклов ЭКО [7]. Оптимизация эффективности ЭКО напрямую связана с решением ключевой проблемы репродуктологии – повышением рецептивности эндометрия (имплантационной восприимчивости), которая занимает ведущую роль в процессе имплантации [8–10].

Рецептивность эндометрия представляет собой комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временны’ м и константами, которые определяют способность эндометрия обеспечить необходимые этапы имплантации: ориентацию бластоцисты в полости матки относительно места будущей имплантации, адгезию на поверхности эндометрия и инвазию трофобласта [11].

Реализация рецептивности эндометрия осуществляется посредством генетических и молекулярных превращений, которые приводят к экспрессии большого количества биологически активных молекул, таких как цитокины, факторы роста, молекулы адгезии и др. «Золотым стандартом» оценки рецептивности эндометрия долгое время считалась биопсия, которую использовали в первую очередь для определения дефекта лютеиновой фазы менструального цикла [12]. Возможность достаточно простого получения эндометриальной ткани породила большие надежды на обеспечения с помощью биопсии необходимой информации о рецептивности эндометрия. Однако ряд исследователей признают, что внутриклеточные и молекулярные признаки изменения состояния ткани не выявляются при гистологической визуализации [13]. Таким образом, сегодня не существует общепринятого метода определения рецептивности эндометрия, и врачам в клинической практике приходится пользоваться простыми методами, такими как определение толщины эндометрия, измеренного на день назначения овуляторной дозы хорионического гонадотропина человека в циклах овариальной стимуляции или на день начала назначения прогестерона в циклах гормонозаместительной терапии [14].

Иммуноцитохимическая верификация экспрессии сигнальных молекул, обеспечивающих имплантационную способность эндометрия, значительно расширяет возможности объективной оценки функциональной готовности эндометрия к имплантации. Знание нарушений экспрессии конкретных сигнальных молекул позволяет повысить объективизацию диагностики, оценить прогноз заболевания, избрать патогенетический метод лечения бесплодия, ассоциированного с патологией эндометрия. Применение молекулярно-морфологических методов анализа позволяет также значительно расширить представления о механизме действия фармакологических препаратов и верифицировать внутриклеточные мишени для их таргетного действия.

С учетом изложенного было проведено сравнительное изучение функциональной морфологии ткани эндометрия человека в условиях клеточного культивирования с целью выяснения механизма действия и эффективности подкожного применения гидролизата плаценты человека (препарат Мэлсмон®, Япония) для таргетной терапии патологических процессов в эндометрии, ассоциированных с бесплодием.

Метод плацентарной терапии был предложен профессором В.П. Филатовым в 1933 г. и первоначально разрабатывался как вспомогательная методика при пересадке тканей; в дальнейшем метод получил гораздо более широкое применение. Анализ номенклатуры официальных лекарственных средств из плаценты свидетельствует о том, что в медицинской практике бывшего СССР применялись 2 препарата, полученные из плаценты человека – взвесь плаценты и экстракт плаценты. К середине 80-х годов в СССР был накоплен внушительный клинический и экспериментальный опыт, подтверждающий эффективность плацентарной терапии при многих нозологиях, в частности для стимуляции заживления ран, рассасывания спаек, при рубцовых поражениях кожи и слизистых оболочек (в том числе рубцовые сужения пищевода, гортани, уретры, атрезия слухового прохода), заболеваниях глаз, трофических расстройствах, заболеваниях нервной системы, хронических воспалительных и аутоиммунных процессах (хронические дерматозы, хроническая обструктивная болезнь легких, туберкулез), в педиатрии и гериатрии, а также в гинекологической практике, при лечении воспалительных процессов, бесплодии, климактерических расстройствах и пр. [15].

К середине ХХ века плацентарная терапия активно применялась за пределами СССР, в частности с середины 50-х годов в Японии на базе токийского университета велись разработки по созданию и тестированию препарата Melsmon, представляющего собой гидролизат плаценты человека (ГПЧ), производство которого началось в 1956 г. В течение 60 лет препарат Мэлсмон с успехом применяется в Японии, в том числе у женщин, как средство для коррекции симптомов пери- и постменопаузы и лечения гипо- и агалактии.

Эффективность ГПЧ в коррекции этих нарушений подтверждена клиническими исследованиями. При этом причиной эффективного купирования симптомов менопаузы на фоне Мэлсмон-терапии являются не увеличение концентрации эстрадиола, а антиоксидантные и противовоспалительные свойства препарата и его способность повышать активность клеточного и тканевого дыхания, приводя в итоге к нормализации состояния организма. Отсутствие гормональной активности препарата дает основание полагать, что его назначение безопасно с точки зрения воздействия на молочную железу, матку, коронарные артерии и риска тромбоза глубоких вен [16].

С 2011 г. аллогенный гидролизат плаценты для подкожного введения Мэлсмон был зарегистрирован на территории РФ как лекарственное (рецептурное) средство для коррекции астенических состояний у женщин в пери- и постменопаузе и стал предметом пристального изучения российских исследователей и клиницистов.

В экспериментальном исследовании in vitro было установлено, что в основе механизма действия препарата Мэлсмон лежит его способность усиливать энергетический потенциал клеток, способствуя нормализации функциональной активности митохондрий. По мнению авторов, это приводит к оптимизации клеточного обмена, тем самым тормозятся формирование и прогрессирование патологических процессов как на клеточном уровне, так и организма в целом [17, 18].

Поскольку в митохондриях интегрированы пути метаболизма белков, жиров и углеводов и осуществляются основные энергетические процессы, регуляция внутриклеточного распределения кальция, образование стероидов, регуляция апоптоза [19, 20], эти данные во многом объясняют эффективность препарата ГПЧ не только в коррекции симптомов перии постменопаузы (астении, ментального дистресс-синдрома и генитоуринарного синдрома у женщин с естественной и ятрогенной менопаузой, в том числе с гинекологическим раком) [21–23], но и в отношении регуляции репродуктивной функции у женщин с недостаточностью лютеиновой фазы менструального цикла [24], при синдроме преждевременной недостаточности яичников [25], и в комплексных протоколах при подготовке к программам ВРТ [26].

При этом анализ литературы показал, что исследований о влиянии препарата ГПЧ для подкожного применения на экспрессию маркеров имплантационной восприимчивости эндометрия не проводилось.

Целью данной работы явилось изучение влияния препарата Мэлсмон на экспрессию маркеров восприимчивости эндометрия к имплантации в норме и при бесплодии in vitro.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал эндометрия (n=21) для создания культур клеток был получен при проведении пайпель-биопсии на 19–22-й день цикла в НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта. Пациентки находились в репродуктивном возрасте (23–45 лет), у всех был нормальный менструальный цикл. Пациентки не получали гормональную терапию (аналоги гонадотропин-релизинг-гормона – ГнРГ, даназол, комбинированные оральные контрацептивы). Диагноз бесплодия различного генеза был поставлен по совокупным данным анамнеза и результатам гистологического исследования биопсийных образцов. В случаях бесплодия, вызванного эндометриозом, степень эндометриоза определяли по шкале Американского общества фертильности. Другими причинами бесплодия были синдром поликистозных яичников, хронический эндометрит и недостаточность функции яичников.

Пассирование клеток производили через 3 дня на 4-й, когда культура достигала состояния моно-слоя. Клетки культивировали до 3-го пассажа. Все культуры были разделены на 3 группы: 1-я – культура эндометрия пациенток без бесплодия; 2-я – культура эндометрия пациенток с бесплодием до 35 лет; 3-я – культура эндометрия пациенток с бесплодием после 35 лет. Препарат Мэлсмон добавляли в культуральные среды в концентрации 200 мкл на 3 мл питательной среды; в каждой группе также проводили контроль путем добавления в культуральные среды физиологического раствора.

Для оценки функциональной активности эндометрия были выбраны сигнальные молекулы, наиболее активно участвующие в регуляции имплантационной восприимчивости эндометрия: кисспептин (KISS1), сиртуин-1 (SIRT1), кальретикулин (CALR) и ароматаза цитохрома Р450.

Экспрессию сигнальных молекул и структурно-функциональную организацию клеток эндометриальных культур изучали молекулярно-морфологическими методами (иммуноцитохимическое маркирование, иммунофлюоресцентная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, морфометрия, 3D-реконструкция, компьютерный анализ микроскопических изображений).

Для иммунофлюоресцентного окрашивания клетки помещали в 24-луночный планшет («Биолот»). В работе использовали первичные моноклональные антитела к Calreticulin (Abcam, 1:200), Aromatase (Abcam, 1:30), Kisspeptin (Abcam, 1:140), SIRT1 (Abcam, 1:250). Для пермеабилизации использовали 0,1% Triton X-100 («Биолот»), растворенный в фосфатном буфере (PBS). Далее культуры клеток инкубировали в 1% эмбриональной телячьей сыворотке (fetal bovine serum, FBS) (pH=7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания. Инкубацию с первыми антителами проводили в течение 60 мин.

Конфокальную микроскопию клеток проводили в инвертированном конфокальном микроскопе «Olympus Fluo ViewFV1000-IX70» с использованием апохроматического объектива «404 UPlan». Для спецификации флюоресценции исследуемых маркеров использовали волну возбуждения диодного 488 нм-мультиаргонового лазера 647 нм. Ядра клеток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma), в результате чего они флюоресцировали синим цветом. Зеленая и красная флюоресценция отражала экспрессию исследуемых маркеров (инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом Alexa Fluor 488 и 647, – 1:1000, Abcam, в течение 30 мин при комнатной температуре, в темноте).

Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений FW-10 и программного обеспечения Vidеotest Morphology 5.2. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении в 400 раз. Измеряли площадь экспрессии, рассчитывая ее как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения для маркеров с цитоплазматическим окрашиванием, и как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными ядрами, к общей площади ядер в поле зрения для маркеров с ядерной экспрессией. Показатели площади экспрессии выражали в %.

Статистическая обработка данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки (Statistica 7.0). Для анализа вида распределе ния использовали критерий Шапиро–Уилка (W-test). Было установлено, что все выборки соответствуют нормальному распределению.

Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускалла–Уоллиса). Для выборок со значительным разбросом применяли процедуры множественных сравнений с помощью критерия Манна–Уитни. Для групп с незначительным разбросом применяли t-критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В культуре эндометрия, полученной от пациенток с бесплодием, исходно площадь экспрессии KISS1 была в 2,3 раза ниже, чем в неизмененном эндометрии. Терапия препаратом Мэлсмон способствовала повышению в 3,5 раза экспрессии KISS1 в культуре в группе с бесплодием до 35 лет. В позднем репродуктивном периоде (после 35 лет) наблюдалось более значимое увеличение экспрессии KISS1 – в 6 раз (рис. 1, а). При этом в контрольных пробах (с физиологическим раствором) повышение экспрессии KISS1 отсутствовало. В то же время в культуре нормального эндометрия, полученного от пациенток без бесплодия, экспрессия KISS1 под действием препарата Мэлсмон не изменялась.

Кисспептин представляет собой пептид, содержащий 145 аминокислотных остатков [27], который синтезируется в гипоталамусе, органах женской половой системы и плаценте. Основная функция KISS1 заключается в подавлении метастазирования опухолей; этот пептид также является ключевым регулятором функций трофобласта при имплантации и участвует в формировании плаценты. KISS1 выполняет роль трансмиттера в передаче сигналов от половых стероидов (эстрогенов, андрогенов), а также осуществляет посреднические функции между лептином и ГнРГ-секретирующими центрами гипоталамуса, таким образом осуществляя процессы «прямой/обратной связи» в пределах гонадной оси и сигнализируя об энергетическом балансе в названные центры. Взаимодействие KISS1 и его клеточного рецептора в мозге является определяющим фактором в активации нейронов, высвобождающих гонадолиберин, который, в свою очередь, управляет секрецией лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), вызывающих в итоге овуляцию. КISS1 был признан одним из самых мощных стимуляторов секреции ЛГ. Расстройства, нарушающие взаимодействие KISS1 и его рецептора, приводят к невозможности овуляции. Кроме того, KISS1 оказывает регуляторное воздействие на степень инвазии трофобласта и ангиогенез, поэтому усиление его экспрессии под воздействием препарата Мэлсмон, является благоприятным фактором для наступления овуляции, имплантации и последующего развития беременности.

В культуре эндометрия в норме экспрессия фактора транскрипции сиртуина-1 (SIRT1) под действием препарата Мэлсмон не изменялась. В культуре клеток эндометрия пациенток с бесплодием моложе 35 лет значения экспрессии были незначительно выше, статистически значимых отличий между группами не наблюдалось. Наибольший интерес представляют данные, полученные в группе пациенток старше 35 лет. В контрольной группе с введением физиологического раствора зафиксировано снижение площади экспрессии SIRT1 в 2,3 раза. Препарат Мэлсмон способствовал повышению в 2,2 раза площади экспрессии SIRT1 в культуре эндометрия с бесплодием в старшей возрастной группе (рис. 1, б).

Сиртуины (Silent Information Regulator proteins) представляют собой семейство эволюционно консервативных НАД-зависимых белков, обладающих деацетилазной или АДФ-рибозилтрансферазной активностью [28]. Сиртуины не только регулируют экспрессию различных генов, используя эпигенетические механизмы (меняя степень конденсации хроматина), но и непосредственно участвуют в устранении повреждений ДНК [29].

Доказано, что сиртуины вовлечены в регуляцию важных клеточных процессов и метаболических путей: процессов старения, транскрипции, апоптоза и сопротивляемости стрессу. Регуляция метаболизма и клеточные защитные механизмы, в которых участвуют сиртуины, могут быть использованы для увеличения продолжительности жизни. SIRT1 экспрессируется во всех органах, но преобладает в наиболее энергетически зависимых тканях. Нокаутирующие мутации в гене SIRT1 ведут к пренатальной и перинатальной гибели, нарушениям гаметогенеза, хроническим инфекциям, атрофии поджелудочной железы.

Восстановление экспрессии SIRT1 до нормальных значений особенно значимо у пациенток старшего репродуктивного возраста, так как при старении накапливаются повреждения ДНК, вызванные мутагенами и окислительным стрессом. Восстановление повреждений способствует нормальной экспрессии генома эндометриальной клетки и ее адекватному ответу на стимулы, поступающие от бластоцисты.

В культуре эндометрия без патологических изменений экспрессия CALR под действием препарата Мэлсмон не изменялась. В культуре эндометрия, полученной от пациенток с бесплодием моложе 35 лет, площадь экспрессии CALR была в 1,8 раза ниже, чем в нормальном эндометрии. Препарат Мэлсмон способствовал повышению в 1,7 раза экспрессии CALR в культуре у пациенток с бесплодием младшей возрастной группы. В контрольной культуре эндометрия, взятой у пациенток старшего репродуктивного возраста, площадь экспрессии CALR была значительно ниже, чем в неизмененном эндометрии (соответственно 8,03 и 18,14%). При воздействии препарата Мэлсмон этот показатель возрастал в 1,8 раза (рис. 2, а).

Таким образом, введение препарата Мэлсмон в культуры эндометрия с бесплодием как в младшей, так и в старшей возрастной группе способствовало восстановлению экспрессии CALR в культурах до нормального уровня.

CALR является многофункциональным кальций-связывающим белком эндоплазматического ретикулума (ЭР). Кроме регуляции внутриклеточной концентрации Са+2, этот белок вместе с кальнексином участвует в формировании третичной структуры белков, обладая функциями шаперона.

CALR связывается с неправильно свернутыми белками и гликопротеинами и предотвращает их транспорт из ЭР к аппарату Гольджи. CALR, локализованный вне ЭР, также выполняет многочисленные функции. CALR регулирует адгезию клеток, процессы их миграции и воздействует на выработку интегринов. CALR необходим для процессирования и представления антигена для адаптивного иммунного ответа. CALR-экспрессирующие дендритные клетки участвуют в фагоцитозе раковых клеток.

Выявленное в нашем исследовании повышение экспрессии CALR под воздействием препарата Мэлсмон у пациенток с бесплодием является фактором, повышающим успех имплантации бластоцисты в эндометрий и фактором адекватной иммунорегуляции.

В культуре эндометрия пациенток с бесплодием обеих возрастных контрольных групп (с введением физиологического раствора), площадь экспрессии ароматазы была соответственно в 6,4 и 8,1 раза выше, чем в неизмененном эндометрии.

Препарат Мэлсмон способствовал снижению экспрессии ароматазы в патологических культурах эндометрия при бесплодии до минимальных значений (соответственно 1,62±0,2 и 2,02±0,3%), таким образом подавляя аутопродукцию эстрогенов (см. рис. 2, б).

Ароматаза цитохрома Р450 является единственным ферментом позвоночных, который катализируют биосинтез эстрогенов из андрогенов: преобразует андростендион, тестостерон и 16α-гидрокситестостерон соответственно в эстрон, 17β-эстрадиол и 17β, 16α-эстриол. В яичнике произведенный эстрадиол действует местно совместно с гонадотропинами, секретируемыми из передней доли гипофиза, чтобы обеспечить успешный фолликулогенез и продукцию стероидов. С другой стороны, своевременный синтез ароматазы в фолликуле яичников отвечает за циклические изменения уровня эстрадиола в сыворотке крови. Эти изменения модулируют структуру и функцию женской репродуктивной системы и необходимы также для созревания ооцитов, оплодотворения и имплантации [30].

Таким образом, своевременная и клеточная экспрессия ароматазы в яичнике имеет решающее значение для аутокринной регуляции фолликулогенеза, эндокринного контроля органов репродуктивной системы и координации секреции гонадотропинов.

В то же время такие заболевания, как эндометриоз сочетаются с повышенной активностью ароматазы и экспрессией мРНК ароматазы цитохрома Р450. Установлено, что ароматаза цитохрома Р450 экспрессируется в эндометрии пациенток с эндометриозом и не экспрессируется в эндометрии менструирующих женщин [31]. Это позволяет предположить, что при указанной патологии в тканях происходит чрезмерный аутосинтез эстрогенов. В свою очередь, эстрогены, взаимодействуя со своими рецепторами, приводят к дальнейшему патологическому росту тканей, что может быть одной из причин бесплодия.

Обнаруженное нами снижение экспрессии ароматазы под воздействием препарата Мэлсмон способствует угнетению процессов, вызванных гиперэстрогенемией (таких как повышенная пролиферация клеток), что может благоприятно сказываться на рецептивности эндометрия при этой патологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали наличие у препарата Мэлсмон биохимических и физиологических свойств, определяющих разнонаправленную активность препарата на экспрессию сигнальных молекул в клетках эндометрия как в норме, так и при патологических состояниях, регулирующих внутри- и межклеточные взаимодействия.

Препарат Мэлсмон обладает свойствами регулировать и оптимизировать состояние эндометрия, восстанавливая его структурно-функциональные характеристики, активируя процессы внутри- и межклеточных коммуникаций, способствующие повышению имплантационной способности эндометрия.

Препарат Мэлсмон обладает способностью ингибировать процесс развития эндометриоза и, в частности, гетеротопий за счет способности регулировать процессы клеточного обновления через усиление апоптоза клеток.

Также препарату Мэлсмон присущи выраженные геропротективный и антипролиферативный эффект, что дает основание для его дальнейшей разработки в качестве регенераторного средства, препятствующего старению, и противоопухолевого средства.

Изучение регуляторных свойств препарата Мэлсмон современными методами молекулярной морфофизиологии показало его несомненную широкую перспективность в качестве потенциального мощного биорегулятора метаболических и физиологических процессов в различных органах и тканях человека как в норме, так и при патологии.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Кулаков В.И., Савельева Г.М., Манухин И.Б. Гинекология. Национальное руководство. ГЭОТАР-Медиа, 2011.
  2. Margalioth E.J., Ben-ChetritA., GalM. еt al. Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET. Hum. Reprod. 2006; 21 (12): 3036–43.
  3. Корнеева И.Е. Современная концепция диагностики и лечения бесплодия в браке: автореф. дис. … д-ра мед. наук. М., 2006.
  4. De Mouzon J. et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2006: results generated fron European registers by ESHRE. Hum Reprod 2010; 25: 1851–62.
  5. Kupka M.S., Ferraretti A.P., de Mouzon J., Erb K., D’Hooghe T., Castilla J.A., CalhazJorge C., De Geyter C., Goossens V. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod. 2014; 29 (10): 2099–113.
  6. Силантьева Е.С. Физические методы структурно-функционального ремоделирования эндометрия у женщин с нарушением репродуктивной функции: дис. … д-ра мед. наук. М., 2008.
  7. Seo W.S., Jee B.C., Moon S.Y. Expression of endometrial protein markers in infertile women and the association with subsequent in vitro fertilization outcome. Fertil. Steril. 2011; 95 (8): 2707–10.
  8. Bourgain C., Devroey P. The endometrium in stimulated cycles for IVF. Hum Reprod Update. 2003; 9 (6): 515–22.
  9. Boomsma C.M., Kavelaars A., Eijkemans M.J., Amarouchi K., Teklenburg G., Gutknecht D., Fauser B.J., Heijnen C.J., Macklon N.S. Cytokine profiling in endometrial secretions: a non-invasive window on endometrial receptivity. Reprod Biomed Online. 2009; 18 (1): 85–94.
  10. Simon A., Laufer N. Repeated implantation failure: clinical approach. Fertil Steril. 2012; 97 (5): 1039–43.
  11. Achache H., Revel, A. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Human Reproduction update. 2006; 12 (6): 731–46.
  12. Devroey P., Fauser B.C., Platteau P., Beckers N.G., Dhont M., Mannaerts B.M. Induction of multiple follicular development by a single dose of long-acting recombinant follicle-Stimulating hormone (FSH-CTP, corifollitropin alfa) for controlled ovarian stimulation before in vitro fertilization. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89 (5): 2062–70.
  13. Coutifaris C., Myers E.R., Guzick D.S., Diamond M.P., Carson S.A., Legro R.S., McGovern P.G., Schlaff W.D., Carr B.R., Steinkampf M.P., Silva S., Vogel D.L., Leppert P.C. Histological dating of timed endometrial biopsy tissue is not related to fertility status. Fertil Steril. 2004; 82 (5): 1264–72.
  14. Шнейдерман М.Г., Калинина Е.А., Смольникова В.Ю. и соавт. Проблема тонкого эндометрия: возможности комбинированного негормонального лечения при подготовке к процедуре экстракорпорального оплодотворения. Гинекология, 2014; 3: 67.
  15. Тканевая терапия, под. ред. Акад. АМН СССР Пучковской Н.А., «Здоров’я», Киев 1975.
  16. Kim J.H., Kim S.H., Lee S.Y. The effect of human placenta extract on postmenopausal symptoms. Estradiol and FSH. Seoul, 2008.
  17. Измайлова Т.Д. Персонализированные протоколы метаболической коррекции как основа anti-age программ. Инъекционные методы в косметологии. 2016; 1: 24–37.
  18. Измайлова Т.Д. Персонализированная PRP-терапия. Алгоритм подготовки пациента. Инъекционные методы в косметологии. 2016; 2: 19–23.
  19. Rustin P, Munnich A, Rotig A: Succinate dehydrogenase and human diseases: new insights into a well-known enzyme. Eur. J. Hum. Genet. 2002; 10 (5): 289–91.
  20. Шабельникова Е.И. Морфофункциональные характеристики митохондрий лимфоцитов у детей при различных формах недостаточности клеточного энергообмена: Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2013; 193.
  21. Оразов М.Р., Радзинский В.Е., Хамошина М.Б. Опыт использования таргетной плацентарной терапии для коррекции менопаузальных симптомов. Хирургическая практика. 2016; 4: 45–53.
  22. Оразов М.Р., М.Б. Хамошина, Т.Н. Бебнева, С.Р.Поликарпова, Возможности гидролизата плаценты человека в комплексном лечении симптомов генитоуринарного синдрома в постменопаузе. Гинекология. 2017; 19 (1): 27–30.
  23. Покуль Л.В., Оразов М.Р., Лебедева М.Г., Бебнева Т.Н., Поликарпова С.Р. К вопросу о возможности аллогенной плацентарной терапии постовариоэктомических проявлений у больных, отягощенных гинекологическим раком, после противоопухолевого лечения, Гинекология. 2017; 19 (1): 30–7.
  24. Оразов М.Р., Радзинский В.Е., Хамошина М.Б., Поликарпова С.Р. 2 Опыт использования гидролизата плаценты человека в лечении недостаточности лютеиновой фазы менструального цикла, Московский хирургический журнал. 2016; 6 (52): 29–36.
  25. Царегородцева М.В., Новикова Я.С., Подолян О.Ф. Преждевременная недостаточность яичников: новые возможности терапии Климактерий. 2016; 3: 26–31.
  26. Силантьева Е.С., Овчинникова М.М., Камилова Д.П., Тищенко М.А., Кузина С.В. Опыт применения аллогенного пептидного препарата Мэлсмон при подготовке к программам вспомогательной репродукции, Женская консультация. 2016; 4: 12.
  27. Taniguchi F., Kaponis A., Izawa M., Kiyama T., Deura I., Ito M., Iwabe T., Adonakis G., Terakawa N., Harada T. Apoptosis and endometriosis. Front Biosci (Elite Ed). 2011; 3: 648–62.
  28. Chen J., Xavier S., Moskowitz-Kassai E. Cathepsin cleavage of sirtuin 1 in endothelial progenitor cells mediates stressinduced premature senescence. Amer. J. Pathol. 2012; 180 (3): 973–83.
  29. Donato A.J., Walker A.E., Magerko K.A. Life-long caloric restriction reduces oxidative stress and preserves nitric oxide bioavailability and function in arteries of old mice. Aging Cell. 2013; 12 (5): 772–83.
  30. Биохимия: учеб. для вузов. Под ред. Е.С. Северина. 2003; 779.
  31. Молотков А.С., Ярмолинская М.И., Полякова В.О., Беженарь В.Ф., Цыпурдеева А.А., Рулев В.В., Дурнова А.О., Цицкарава Д.З. Значение экспрессии ароматазы в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Молекулярная медицина. 2012; 4: 41–4.

Генетика, персонализированная и прогностическая медицина: Проекты направления

1. Ген-направленные соединения для терапии и диагностики

2. Создание редуцированной in vitro системы для изучения молекулярных механизмов аллергического воспаления

3. Поиск и изучение новых продуцентов антибиотиков
4. Профиль секретируемых внеклеточных везикул как показатель активации иммунокомпетентных клеток

5. Увеличение противоопухолевой активности CAR-T клеток человека посредством модуляции активности фосфатазы Wip1

6. Разработка клеточной модели спинальной мышечной атрофии

Описание проектов
список и описание проектов предварительные и могут быть изменены и уточнены

1. Ген-направленные соединения для терапии и диагностики

Руководитель проекта: Новопашина Д.С.

Аннотация: Уникальное свойство нуклеиновых кислот (НК) образовывать комплементарные комплексы (формирование пар A:T(U) или G:C в процессе гибридизации) позволяет создавать конструкции направленные на определенные участки конкретных генов. Этот подход  широко используется в молекулярной биологии и медицине для создания ген-направленных соединений. Опираясь на нуклеотидную структуру (последовательность) гена можно сконструировать олигонуклеотид (короткий фрагмент НК), который будет селективно связываться с этим геном или его иРНК (НК-мишень) и блокировать его экспрессию, то есть не будет синтезироваться белок, соответствующий этому гену. Если в такой олигонуклеотид ввести флуоресцентную метку, то можно получить гибридизационный зонд и детектировать, соответствующий ген или его мРНК. Важным моментом является стабильность комплекса ген-направленного олигонуклеотида  с его НК-мишенью.

Существуют физические методы, позволяющие определять параметры взаимодействия между биомолекулами, например, между ген-направленным соединением и его НК-мишенью, то есть определять константы ассоциации/диссоциации комплексов и прогнозировать  возможную биологическую эффективность ген-направленных соединений в реальных биологических системах. Наиболее удобным методом детекции образования комплексов является использование флуоресцентных меток, которые могут быть введены в состав НК-мишени (РНК или ДНК) ферментативно или путем химического мечения, а также в состав ген-направленного соединения на основе комплементарного определенному фрагменту НК-мишени.  В кастве таких меток могут быть использованы флуоресцеин, цианиновые красители и другие флуоресцентные молекулы. При использовании различных систем визуализации флуоресцентно меченных соединений необходимо осуществить выбор оптимального флуоресцентного красителя, а также  положение и способ  его введения в состав исследуемой системы соединение/НК-мишень.

Данный проект направлен на создание флуоресцентно меченных ген-направленных соединений. В ходе проекта мы научимся вводить флуоресцентные метки в нуклеиновые кислоты химическим путем. Кроме того мы проведем исследование их связывания с НК-мишенями используя их флуоресцентные свойства и способность образовывать комплементарные комплексы. Результаты проекта будут представлять практическую ценность для создания научно-исследовательских инструментов, перспективных инструментов терапии и диагностики генетических заболеваний. 

Партнер проекта: Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

2. Создание редуцированной in vitro системы для изучения молекулярных механизмов аллергического воспаления

Руководитель проекта: Друцкая М.С.

Аннотация: Астма – это распространенное хроническое заболевание, которым страдает более 300 миллионов человек во всем мире. Оно характеризуется воспалением дыхательных путей, утолщением гладкой мускулатуры бронхов, высокой чувствительностью к аллергенам, одышкой, тяжестью и хрипами в груди. Патогенез астмы, как правило, связан с активным привлечением в легочную ткань иммунных клеток, в частности, миелоидных клеток (например, гранулоцитов, макрофагов, дендритных и тучных клеток). Все эти клетки распознают различные аллергены с помощью рецепторов врожденного иммунитета, активируются и начинают высвобождать особые белки иммунной системы – цитокины (например, интерлейкины, интерфероны, хемокины). При этом чрезмерная активация этих клеток может приводить к нарушенной регуляции цитокинов и, как следствие, способствовать развитию неконтролируемого аллергического воспаления и, в конечном итоге, к астме. 

Модель экспериментальной астмы основана на взаимодействии аллергенов в составе экстракта пылевого клеща (липополисахарид, флагеллин, хитин, бета-глюкан и др.) с рецепторами врожденного иммунитета, Toll-подобными рецепторами, которые представлены на поверхности всех миелоидных клеток и активируют иммунный ответ против разных типов патогенов. Участникам проекта будет предоставлена возможность, применяя базовые методы культуральной работы в клеточном блоке и молекулярно-биологического анализа, исследовать последствия активации макрофагов, нейтрофилов и дендритных клеток, как отдельными аллергенами, так и смесью аллергенов. Работа включает в себя получение первичных культур миелоидных клеток из костного мозга мышей, их активацию и последующий анализ сигнальных путей от Toll-подобных рецепторов с помощью измерения экспрессии основных медиаторов аллергического воспаления методами количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени и иммуноферментного анализа. Проверка специфичности передачи сигнала будет проводиться на культурах миелоидных клеток, полученных из костного мозга генетически модифицированных мышей, с дефектами в передаче сигнала от Toll-подобных рецепторов. Изучение особенностей активации миелоидных клеток отдельными компонентами экстракта пылевого клеща будет способствовать поиску новых подходов к лечению аллергической астмы.

Партнер проекта: Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской академии наук

 

3. Поиск и изучение новых продуцентов антибиотиков

Руководитель проекта: Остерман И.А.

Аннотация: В связи с высокими темпами распространения устойчивости к классическим антибиотикам необходимо искать новые источники и новые молекулы, обладающие антибактериальной активностью. В ходе проекта будет проведен поиск и культивирование в лабораторных условиях новых штаммов-продуцентов антибиотиков. При помощи специализированного штамма-биосенсора, будет определена эффективность, а главное механизм действия продуцируемой молекулы. Наиболее активные образцы будут выращены в больших объемах для выделения активного компонента, затем будет проведено определение структуры продуцируемого антибиотика.  Будет проведено морфологическое и генетическое определение штаммов-продуцентов,  а для наиболее перспективных будет проведено выделение геномной ДНК, с целью дальнейшего получения генома штамма продуцента и определения набора генов, отвечающих за биосинтез антибиотика.

Проект предполагает несколько блоков:

1. Знакомство с микробиологическими приемами в целом. Приготовление сред, жидких, агаризованных селективных, индикаторных и т.д. из отдельных компонентов и готовых смесей. Приёмы стерилизации, подготовка материалов, розлив по чашкам и т.д. Анализ штаммов продуцентов. В качестве материалов используются штаммы Strepromyces из коллекций, но с не описанными продуктами, которые они продуцируют.

— Участники получают на руки пробирки со стрептомицетами и чашки со средами, сеют стрептомицеты на спектр ISP сред (международный стандарт для описания фенотипических свойств актиномицетов). Наблюдение за ростом культур и описание культуральных признаков происходит на 7, 14, 21 сутки.

— Засеваются стрептомицетами чашки петри с крахмальнной средой,– чтобы вырезать блоки для определение антибактериальной активности.

— Посев на  2-3 жидкие среды, культивироваие, тестирование антибактериальной активности.

— Микросокпические исследования продуцентов.

— Выделение геномной ДНК, делаем ПЦР на 16S, определяем видовую принадлежность.

2. Выделение активных компонентов из сред штаммов-продуцентов. Используются обнаруженные активные продуценты или уже ранее наработанные культуральные жидкости продуцентов. Знакомство с базовыми методами очистки малых молекул – экстракция и хроматография. Анализ фракций при помощи репортерной системы pDualrep2. Определение физико-химических параметров выделенной молекулы. Попытка установления ее структуры.

3. Отбор наиболее перспективных кандидатов на полно геномное секвенирование, знакомство с принципами поиска биокластеров антибиотиков.

Партнер проекта: Сколковский институт науки и технологий

 

4. Профиль секретируемых внеклеточных везикул как показатель активации иммунокомпетентных клеток

Руководитель проекта: Головкин А.С.

Аннотация: Иммунокомпетентные клетки (Т- и В-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки и др) являются участниками многих патологических и физиологических процессов. Они отвечают за иммунный ответ, защиту организма от патогенов, опухолей, чужеродных и аутологичных молекул, потенциально опасных для организма, и т.д. Регуляция активности иммунокомпетентных клеток осуществляется разными путями, в частности через рецепторы, цитокины, хемокины и т.д. При этом последнее время активно изучается возможное регуляторное влияние внеклеточных везикул, продуцируемых иммунокомпетентными клетками.

Внеклеточные везикулы (ВВ) – окруженные липидным бислоем частицы диаметром менее 1000 нм. Этот класс объединяет объекты, описываемые в литературе как экзосомы, эктосомы, микровезикулы, микрочастицы и апоптотические тела. ВВ являются переносчиками активных биомолекул между разными клетками, в связи с чем рассматриваются как потенциальные регуляторы многих физиологических и патологических процессов в клетке. С помощью современных методов исследования было показано, что субпопуляции ВВ содержат разные наборы кодирующих и некодирующих РНК, включая микроРНК, белки, а также различаются по липидному составу. 

Цель: изучить профиль различных фракций внеклеточных везикул, продуцируемых культурой иммунокомпетентных клеток при их стимуляции. Для этого планируется на культуре клеток THP-1 (клетки моноцитарной лейкемии человека) в покое и при стимуляции, используя дифференциальное центрифугирование получить две фракции внеклеточных везикул. Провести анализ фракций внеклеточных везикул методом высокочувствительной проточной лазерной цитометрии, белковый анализ фракций внеклеточных везикул методом Вестерн-Блот-анализа и анализ на наличие митохондриальной ДНК методом ПЦР.

Партнер проекта: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федераци

 

5. Увеличение противоопухолевой активности CAR-T клеток человека посредством модуляции активности фосфатазы Wip1

Руководитель проекта: Демидов О.Н.

Аннотация: В последнее время для лечения онкологических заболеваний стала широко применяться иммунотерапия – комплекс лечебных мероприятий, направленных на увеличение эффективности иммунной системы в уничтожении опухолевых клеток. Одним из примеров подобной терапии, зарекомендовавшей себя при лечении рака кожи и ряда других злокачественных опухолей, является устранение сигналов, инструктирующих подавление иммунного ответа на раковые клетки. За открытие механизмов данной иммунотерапии в 2018 году была присуждена Нобелевская премия. 

Другим типом иммунотерапии, пока еще только внедряемым в клиническую практику, является применение для борьбы с опухолями иммунных клеток, лимфоцитов, которые специально программируются на уничтожение опухолевых клеток. Программирование T-лимфоцитов достигается с помощью внедрения методами биомедицинской инженерии на поверхность этих клеток молекул, узнающих опухолевые клетки. Внедряемые молекулы получили название «химерные рецепторы к антигенам» опухолей (англ. Chimeric Antigen Receptor – CAR), а клетки стали называться CAR-T клетками. Цитотоксические (способные уничтожать клетки) Т-лимфоциты, которые используются для создания CAR-T клеток, синтезируют ряд противоопухолевых молекул, способных проникать внутрь опухолевых клеток и запускать процесс их гибели.  В настоящее время ведется активный поиск способов увеличения эффективности CAR-T клеток, например, путем увеличения их жизнеспособности или путем повышения синтеза и секреции противоопухолевых молекул: гамма-интерферона, перфоринов, гранзимов. 

Ранее в процессе исследования влияния различных факторов на противоопухолевый иммунный ответ нами было обнаружено, что удаление гена фосфатазы Wip1 из клеток иммунной системы мыши значительно усиливает противоопухолевый иммунный ответ и замедляет рост опухолей. На основании полученных нами данных мы сформулировали Цель исследования: увеличить эффективность CAR-T клеток в уничтожении опухолей, используя вместо генетического удаления Wip1, химическое вещество-ингибитор, подавляющее активность Wip1.

Участники проекта будут самостоятельно растить вышеуказанные клетки в специальных чашках для культивирования, оценивать способность СAR-T клеток уничтожать опухолевые клетки-мишени до и после применения  химического вещества- ингибитора, подавляющего активность Wip1,  производить количественную оценку синтеза и секреции противоопухолевых молекул СAR-T клетками (гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, гранзима В) методами количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитометрии (FACS).

Партнеры проекта: Институт цитологии Российской академии наук, Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А.Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации

6. Разработка клеточной модели спинальной мышечной атрофии

Руководитель проекта: Мадера Д.А.

Аннотация: Ген SMN1 кодирует белок, отвечающий за множество функций, связанных с реализацией генетической информации в клетке. В частности, при нарушении экспрессии данного гена в клетках наблюдается аномальный сплайсинг различных РНК, неправильное разрешение дуплексов ДНК-РНК, образующихся при транскрипции и т. д. 

Мутации в гене SMN1, приводящие к потере его функции, являются причиной смертельного или инвалидизирующего наследственного заболевания спинальная мышечная атрофия (СМА), вызванного деградацией и смертью моторных нейронов и, как следствие, деградацией мышечной ткани. Для лечения таких больных возможно создать вирусный препарат, который восстанавливает экспрессию и функцию SMN1. Конечно, проще всего проверить просто экспрессию гена и белка в трансдуцированных клетках, однако правильнее проверять востановление функции гена, и это является важнейшим показателем выбора конкретного варианта гена для препарата.

Оптимальным (наиболее быстрым и дешёвым) методом проверки вариантов препаратов является их проверка на клеточных моделях. В клетках можно «имитировать» отсутствие SMN1 с помощью ингибирования малыми интерфериующими РНК (siRNA), а потом восстановить с помощью прототипов вирусного препарата для экспрессии SMN1. 

В рамках данного проекта предлагается разработать функциональные тесты на основе ПЦР, которые будут детектировать определённую функцию SMN1, и проверить, какие варианты вирусного препарата лучше её восстанавливают. От компании Биокад будут предоставлены образцы тотальной РНК клеток, трансдуцированных несколькими прототипами препаратов, для сравнения. Это важный этап для разработки препарата и выстраивания биотехнологической цепочки к производству.

Партнер проекта: ЗАО «Биокад»

О лаборатории — Лаборатория иммуногистохимии

Отдел обладает возможностью исследования более 200 различных маркеров (белков), а также основных транслокаций с использованием технологии in situ гибридизации, что позволяет проводить иммуногистохимическое и FISH исследования всех онкологических заболеваний: мягкотканных и костных сарком, лимфом, образований печени: дифференциальную диагностику между доброкачественными образованиями, первичными злокачественными опухолями и метастазами рака. Иммуногистохимическое и FISH исследования опухолей молочной железы и желудка имеют основополагающее значение для назначения таргетной терапии, проводятся на современном оборудовании, отвечающего стандартам России, Европы и США.

Одним из направлений научно-практической деятельности отдела является исследование экспрессии генов репарации неспаренных нуклеотидов ДНК (MMR) при аденокарциноме толстой кишки (рисунок 1), раке эндометрия, других локализаций. В настоящее время определение потенциала злокачественности рака толстой кишки, назначение адекватной химиотерапии невозможно без анализа микросателлитной нестабильности (MSI), определения экспрессии генов репарации неспаренных нуклеотидов ДНК (ВОЗ, 2012 год). Кроме того, MSI и MMR имеют важное значение для эффективности иммунотерапии, одного из самых перспективных методов лечения в онкологии.



Рисунок 1. На микрофотографиях продемонстрированы две противоположные ситуации: а. имеется экспрессия генов MMR (коричневое окрашивание ядер клеток), означающее что пациенту показано стандартное лечение; б. отсутствие экспрессии одного из генов MMR (синее окрашивание ядер опухоли, коричневое окрашивание ядер слизистой оболочки) означает, что опухоль резистентна с 5-фтор-пирмидинам, прогностически более благоприятная и чувствительна к иммунотерапии.

Отдел проводит клинические испытания диагностических тест-систем, в том числе по определению PD-L1 (рисунок 2), необходимого для целенаправленного назначения иммунотерапии.



Рисунок 2. Позитивная реакция на PD-L1 саркоматоидном раке легкого (чувствительность к иммунотерапии), опухоли, резистентной к стандартным линиям лечения. Рисунок 3. Позитивная реакция на HER2/neu в аденокарциноме толстой кишки. Опухоль чувствительна к трастузумабу.

Постоянно идет поиск новых предиктивных маркеров, необходимых для индивидуализации лечения онкологических больных (рисунок 3).

Молекулярные технологии все активнее используются в онкологии. В настоящее время при многих локализациях опухолей назначение лечения невозможно без определения специфических мутаций (k-Ras, b-Raf и др.). Использование лазерного микродиссектора позволяет выделять опухоль, которая лишена ненужных для исследования тканей (стромы, воспалительного инфильтрата и т.д.), что помогает избежать ложноотрицательных и ложноположительных результатов при молекулярном исследовании.

Осуществляется консультативная деятельность по морфологической диагностике онкологических заболеваний с использованием широкой панели иммуногистохимических маркеров. Сканирование микропрепаратов дает возможность консультации через интернет, что особенно важно в случае противоречивых результатов. Пациенту нет необходимости ехать в другую страну с биологическим материалом, а достаточно переслать специалисту веб-ссылку.

Лаборатория иммуногистохимии оснащена современным высокоточным оборудованием. Иммуноавтостейнер Ventana последнего поколения позволяет получать стандартизированные результаты при иммуногистохимическом исследовании, отвечающие всем международным и отечественным требованиям. Сканер микропрепаратов дает возможность осуществлять их консультацию через интернет, что особенно важно в случае противоречивых результатов. Лазерный микродиссектор позволяет выделять ткань опухоли, что улучшает результаты молекулярных исследований.



Иммуноавтостейнер Ventana. Сканер микропрепаратов Pannoramic 250.



Лазерный микродиссектор.

Кроме консультативно-диагностической, научной работы отдел проводит краткосрочные курсы по обучению на рабочем месте иммуногистохимическим и молекулярно-генетическим (гибридизация in situ) технологиям и интерпретации результатов.

ЭКСПРЕССИЯ — это… Что такое ЭКСПРЕССИЯ?

  • ЭКСПРЕССИЯ — (лат., от exprimere выражать). Выразительность: в живописи, в музыке, сценической игре и проч. Словарь иностранных слов, вошедших в состав русского языка. Чудинов А.Н., 1910. ЭКСПРЕССИЯ выразительность, преимущ. в сценич. игре и в живописи.… …   Словарь иностранных слов русского языка

  • экспрессия — выразительность; сила проявления чувств, переживаний. Экспрессивные реакции являются внешним проявлением эмоций и чувств человека в мимике, пантомимике, голосе и жестах. Хотя экспрессия у человека генетически детерминирована, она сильно зависит… …   Большая психологическая энциклопедия

  • экспрессия — См …   Словарь синонимов

  • экспрессия — и, я. expression f. &LT;, лат. expressio выражение. 1. устар. Выражение, слово. Если на пассаж &LT;пасквиля&GT;, до меня касающийся, ответствовать труд заслуживает, всенижайше предлагаю, не употребить ли следующих, или тому подобных экспрессий:… …   Исторический словарь галлицизмов русского языка

  • Экспрессия — * экспрэсія * expression 1. . 2. Синтез белка в клетке, который кодируется геном, конкретным для каждого из белков. Процесс Э. включает в себя транскрипцию ДНК, процессинг полученного продукта мРНК и его трансляцию в активный белок. В этом случае …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ЭКСПРЕССИЯ — [рэ], эксрессии, мн. нет, жен. (лат. expressio выражение) (книжн.). То, что придает выразительность чему нибудь, что делает что нибудь выразительным. Он спел романс о большой экспрессией. Экспрессия жеста, лица, слова. «Вы поглядите, сколько… …   Толковый словарь Ушакова

  • экспрессия — экспрессия. Произносится [экспрэссия] и [экспрессия] …   Словарь трудностей произношения и ударения в современном русском языке

  • ЭКСПРЕССИЯ — выразительность; яркое, значительное проявление чувств, настроений, мыслей …   Большой Энциклопедический словарь

  • ЭКСПРЕССИЯ — ЭКСПРЕССИЯ, и, ж. (книжн.). Выражение чувств, переживаний, выразительность. Декламировать с большой экспрессией. Толковый словарь Ожегова. С.И. Ожегов, Н.Ю. Шведова. 1949 1992 …   Толковый словарь Ожегова

  • экспрессия — (гена) [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN expression …   Справочник технического переводчика

  • Заблаговременное планирование лечения: важность выражения ваших медицинских пожеланий

    Пандемия коронавируса заставила всех нас болезненно осознать
    наша смертность. Тем не менее, в это время неопределенности у нас есть выбор.
    можно сделать о том, как мы живем — и умрем.

    «Заблаговременное планирование здравоохранения» позволяет людям задуматься о том, что для них важно, и какие меры они хотели бы предпринять, если заболеют в критическом состоянии, — говорит Грант Смит, доктор медицины, доцент кафедры медицины в Стэнфордской медицине.Смит является экспертом в области паллиативной помощи, которая направлена ​​на облегчение симптомов и улучшение качества жизни пациентов с серьезными заболеваниями.

    Он говорил со мной о том, как заблаговременное планирование медицинского обслуживания может повлиять на жизнь людей.

    Что такое заблаговременное планирование медицинского обслуживания и почему оно так важно?

    Речь идет о принятии решений о медицинском обслуживании, которое вам нужно.
    получить, если вы серьезно заболели и не могли говорить за себя.Первый,
    это ваше собственное планирование, размышления о том, какой уход вы хотели бы получить. В
    вторая часть — подумать о том, что бы произошло, если бы вы не могли говорить за
    себя. Мы рекомендуем, чтобы люди назначили человека, который мог бы вмешаться, чтобы сделать
    решения за них, если они не могут общаться.

    Как коронавирус изменил предварительное планирование здравоохранения?

    Главное, что сделал коронавирус, — это вызвал проблему
    на передний план. Фактические шаги, вопросы и разговоры, которые нам нужны
    иметь с нашими близкими очень похожи на те, которые мы должны иметь
    вне пандемии.

    Разве такое планирование только для пожилых людей?

    Об этом стоит подумать и молодежи. Я молод — 34 года. Я
    у меня нет основного заболевания, но я составил план для себя. Нет
    крепкое здоровье гарантировано на неопределенный срок. Будь то авария или
    инфекция, существует вероятность внезапного серьезного заболевания. И
    для меня наличие плана помогает мне чувствовать себя более комфортно и меньше беспокоиться
    об этой возможности.

    Какие ключевые вещи следует учитывать и обсуждать с членами семьи и опекунами?

    Первое, о чем следует подумать, — это ваше текущее здоровье.
    положение дел.Как мое здоровье? Есть ли у меня сопутствующие заболевания? Есть ли у меня состояние
    что могло быть ограничением жизни?

    Во-вторых, учитывая состояние вашего здоровья, подумайте о том, что больше всего
    важно для вас. Что делает жизнь стоящей? Например, для меня
    то, без чего я не мог бы жить, — это узнавать и осмысленно взаимодействовать с моими
    друзья и семья. Если бы я серьезно заболел, я бы все сделал
    возможно вернуть меня к этому. Если бы стало ясно, я бы не стал
    верни это, я бы не хотел, чтобы мои врачи или семья искусственно продлевали мою
    жизнь.

    Следующий шаг — назначить суррогатного лица, принимающего решения, которое могло бы вмешаться, чтобы принять решение, если бы вы не смогли. Затем вам следует заполнить предварительное распоряжение, которое представляет собой письменный документ о ваших целях или приоритетах, о вещах, которые важны для вас, и о медицинских вмешательствах, которые вы бы хотели или не хотели бы получить, если бы серьезно заболели.

    Опросы показали, что до 90% людей считают важным поговорить с близкими о своих желаниях в конце жизни, но на самом деле это сделали менее трети.Почему?

    Может быть трудно и страшно думать о времени, когда мы
    очень больны или умирают. Чувствовать себя некомфортно — это нормально
    с этим. И для себя, и для своих пациентов я стараюсь думать об этом как о чем-то
    это воодушевляет и утешает, зная, что члены семьи
    руководство для принятия решений, и что все это не будет на их плечах.

    Я часто говорю членам семьи, что предварительное указание
    своего рода подарок, который они делают членам своей семьи.Тогда их семья
    Члены в честь этого получают подарок, который они возвращают своим близким.
    Все в нашей команде видели трудности, когда у нас нет четкого
    руководство — когда семьи борются и переживают тревогу или страдания
    потому что они не говорили об этом со своими близкими. Мы также видели
    наоборот — когда печальная или трудная ситуация облегчается, с меньшими затратами
    эмоциональные страдания, когда члены семьи чувствуют, что у них есть руководство.

    Какие ресурсы доступны, чтобы помочь людям в этом процессе?

    Ваш лечащий врач, который знает вас лучше всего, — отличный ресурс.На веб-сайте паллиативной помощи Стэнфорда также есть отличные ресурсы для пациентов и их семей, в том числе информация о паллиативной помощи и COVID-19.

    Фото Этьена Буланже

    Роль сочувствия в медицине: взгляд студента-медика | Журнал этики

    На протяжении всей медицинской школы мои преподаватели подчеркивали важность эмпатии, обычно определяемой как понимание эмоционального состояния другого человека и отождествление с ним.Сочувствие и сочувствие, которые обычно путают друг с другом, — это не одно и то же. Сочувствие — это выражение эмоциональной озабоченности, а сочувствие — отражение эмоционального понимания. Применение эмпатии широко распространено [1,2] и особенно актуально в таких областях, как медицина, где успешное лечение пациентов зависит от эффективного взаимодействия пациента и врача. В этой статье исследуется концепция эмпатии и ее полезность в медицине с точки зрения студента-медика.

    Что такое сочувствие?

    Эмпатия — это эмоциональное переживание между наблюдателем и субъектом, в котором наблюдатель на основе визуальных и слуховых сигналов определяет и временно переживает эмоциональное состояние субъекта [3]. Чтобы восприниматься как эмпатический, наблюдатель должен передать это понимание субъекту. На начальном этапе процесса наблюдатель должен не только определить, но и понять основу чувств объекта. Например, врач может встретить пациента, который выглядит подавленным, выражает чувство печали и сообщает врачу, что его близкий родственник недавно скончался.Это может заставить врача подсознательно вспомнить свое эмоциональное состояние во время аналогичной ситуации, в которой умер близкий родственник. С другой стороны, он, возможно, не пережил смерть в своей семье, но может понимать эмоциональную реакцию на смерть в культуре пациента. В обеих этих ситуациях он может реагировать сочувственно, потому что он понимает текущее горе пациента и может относиться к нему. В другой ситуации врач может иметь другое культурное прошлое, в котором смерть ассоциируется не с печалью, а с радостью и празднованием жизни умершего.Из-за противоречивых ассоциаций со смертью врач может смутиться, потому что не понимает причины горя пациента. Без понимания природы и обстоятельств эмоционального состояния пациента врачу может быть трудно вызвать эмпатический ответ.

    Однако эмпатическое понимание — это не просто знание и оценка объективной информации о пациенте. Исследователи обнаружили, что друзья-мужчины обладают большей эмпатической точностью, чем незнакомые мужчины [4].Хотя это и неудивительно, интересно отметить, что более высокая точность коррелировала с более высоким качеством совместно используемой информации, а не с большим количеством информации . Этот результат особенно важен для практикующих врачей, поскольку он указывает на то, что недостаточно знать большой объем фактической информации о пациенте. Врач, который понимает каждого пациента на личном уровне, имеет гораздо больше шансов испытать и передать сочувствие и эффективно лечить пациента и болезнь, чем врач, у которого нет такого уровня понимания.

    Также важно, чтобы врач обладал достаточными коммуникативными навыками, чтобы передать пациенту чувства, которые он испытывает. В повседневной жизни люди, которые плохо общаются и не могут адекватно выразить свои чувства, неправильно понимаются окружающими. Таким образом, врач может восприниматься как не имеющий сочувствия, когда на самом деле он чувствует сочувствие, но не может его выразить. И наоборот, врач, который на самом деле может не испытывать сочувствия, все же может вызвать соответствующий ответ, потому что он понимает, как ему следует реагировать в ситуации, и обладает прекрасными коммуникативными навыками [5].Как показывают эти примеры, многие факторы влияют на формирование, выражение и восприятие эмпатической реакции.

    Клиническая эмпатия

    Исследователи давно изучали и обсуждали полезность эмпатии в медицине и получили разные результаты. Некоторые утверждают, что врач не может искренне сопереживать каждому пациенту — это было бы эмоционально истощающим и трудным в современных условиях [6]. Эти исследователи рисуют картину врача, который лучше всех может заботиться о своих пациентах, оставаясь «клинически отстраненным» [7].Утверждается, что не будучи эмоционально вовлеченным в дела пациентов, отстраненный врач может принимать объективные решения относительно их лечения.

    Тем не менее, появляется все больше свидетельств того, что при выборе врача пациенты ценят аффективное беспокойство так же, если не больше, чем техническую компетентность [6]. Будучи студентом-медиком, я часто слышал описания характеристик «хорошего врача» от пациентов, инструкторов и даже членов моей семьи. Единственное свойство, которое всегда упоминалось как необходимое для того, чтобы быть хорошим врачом, — это умение слушать.Каждый пациент хочет, чтобы к нему относились как к человеку, а не как к болезни, и он хочет, чтобы врач понимал немедицинские аспекты его состояния. Врач может внимательно прислушиваться к пациенту, но единственный способ узнать это для пациента — это отразить, что он понимает заботы пациента; т.е. реагировать сочувственно. Если цель медицины — вылечить пациента — облегчить страдания, а не просто вылечить болезнь, — тогда сочувствие является необходимым клиническим навыком.Таким образом, кажется, что врач должен выполнить трудный акт внутреннего уравновешивания: слишком эмоционально увлеченный пациентом, он может потерять объективность; из-за того, что она недостаточно вовлечена, она может потерять способность общаться как человек.

    Исследования показали, что сочувствие полезно и на других уровнях; Было обнаружено, что он оказывает прямое терапевтическое действие, уменьшая тревогу у пациентов [7]. Когда пациент чувствует, что врач понимает его состояние и опасения, он может чувствовать себя более комфортно, доверившись врачу.Этот процесс рассказа своей истории может иметь терапевтический эффект [8], а также может способствовать процессу исцеления. Более того, пациенты часто прямо не заявляют о своих психосоциальных проблемах [9], которые могут проявляться в виде физических заболеваний (соматизации). Распространенность соматоформных расстройств оценивается в 30% [10] и может быть диагностирована только врачом, который внимательно относится к пациенту [11]. И, наконец, сочувствие полезно врачам; было продемонстрировано, что врачи, которые больше ориентированы на психосоциальные потребности своих пациентов, с меньшей вероятностью испытают выгорание [12].

    Преподавание и обучение сочувствию

    Хотя нет единого мнения о наилучшем методе этого, многие исследователи в настоящее время считают, что можно научить и научиться сочувствию [13-15]. При рассмотрении способов развития способности к эмпатии важно учитывать, что эмпатические реакции являются результатом взаимодействия поведенческих и эмоциональных факторов. Таким образом, возможно, что повышение чувствительности к любому из этих факторов улучшит способность к эмпатической реакции.Например, улучшение навыков наблюдения должно облегчить определение эмоционального состояния пациента, а улучшение коммуникативных навыков должно помочь врачу передать свои чувства пациенту.

    Реальному эмоциональному процессу эмпатии могут помочь такие упражнения, как саморефлексивное письмо, которое помогает наблюдателю лучше осознавать свои собственные эмоции и впоследствии улучшает свою способность сочувствовать другим [14]. Культурное образование и широкий круг интересов должны дать врачам более широкие возможности для понимания пациента и установления контакта с ним, что повысит вероятность эмпатической реакции.Наконец, недавно было высказано предположение, что врачи, которые действуют эмпатически, могут восприниматься пациентами как действительно эмпатические [5]. Врачи, практикующие эту технику «глубокого действия», со временем могут научиться искренне сочувствовать; таким образом, обучение актерскому мастерству может быть методом обучения сочувствию [5].

    Заключение

    В течение первых двух лет нашего медицинского образования мы с одноклассниками обучались эмпатии и медицинскому профессионализму в рамках курса, который также предполагал культурную осведомленность и отношения между пациентом и врачом.Методы курса включали уроки культурной осведомленности, обсуждения этики и ролевые игры, в которых мы играли роль врача, пациента и других членов группы по уходу. Во время типичной сессии мы посещали лекцию, а затем собирались группами по 24 человека, чтобы изучить текущую тему с нашими наставниками. Каждой теме было посвящено несколько занятий, после которых от нас требовалось заполнить письменную форму для самоанализа.

    Изначально мне было сложно понять важность этих занятий.Я ценил намерения нашего инструктора, но часто чувствовал, что материал можно было бы преподнести более эффективно. Оглядываясь назад, я, вероятно, был одним из самых мягких критиков этого курса; Большое количество студентов не относились к учебной программе серьезно, считая ее пустой тратой времени, которую можно было бы лучше потратить на учебу. Возможно, это отражает взгляды многих людей в медицинском сообществе, которые считают культурное образование и профессиональную подготовку «мягкими». Другая возможность состоит в том, что студенты-медики, которые на протяжении всей своей академической карьеры учились ценить объективную успеваемость, просто не хотят тратить свое время на предмет, который невозможно измерить объективно.

    Переломный момент для меня наступил, когда я работал над этим эссе. После нескольких месяцев исследований и обсуждений с моими наставниками я начал понимать, что наш курс профессионализма создает базу знаний и опыта, которые мы можем использовать при общении с пациентами. Компьютер может прочитать список признаков и симптомов и поставить диагноз, но у него нет опыта и культурных знаний, на которые можно было бы опираться, которые позволили бы лечить человека, а также болезнь.Эмпатический компонент медицины — вот что делает врача особенным; без него мы, по сути, являемся высококвалифицированными компьютерами.

    Задача преподавателей-медиков состоит в том, чтобы представить информацию в формате, который делает ее актуальной и привлекает студентов. Хотя студенты могут не сразу увидеть ценность этого типа образования, нам на пользу то, что мое поколение врачей специально обучено эмпатии и профессионализму. Подобные программы создают прочную основу для эмпатического взаимодействия и дают нам инструменты, позволяющие быть как эффективными коммуникаторами, так и квалифицированными врачами.

    Список литературы

    1. Элам CL.
      Использование «эмоционального интеллекта» как одного из показателей некогнитивных характеристик абитуриентов медицинских вузов.

      Акад. Мед. .

      2000; 75 (5): 445-446.

    2. Элам С., Страттон Т.Д., Андриковский М.А.
      Измерение эмоционального интеллекта абитуриентов медицинских вузов. Акад. Мед. .

      2001; 76 (5): 507-508.

    3. Buie DH.
      Сочувствие: его природа и ограничения.

      J Am Psychoanal Assoc .

      1981; 29 (2): 281-307.

    4. Стинсон Л., Икес В.
      Эмпатическая точность во взаимодействии друзей-мужчин с незнакомцами-мужчинами.

      J Pers Soc Psychol .1992; 62 (5): 787-797.

    5. Ларсон Э.Б., Яо Х.
      Клиническая эмпатия как эмоциональный труд в отношениях пациент-врач.

      ЯМА .

      2005; 293 (9): 1100-1106.

    6. Зинн В.
      Эмпатический врач.

      Арк Интерн Мед. .

      1993; 153 (3): 306-312.

    7. Халперн Дж.Что такое клиническая эмпатия? J Gen Intern Med. 2003; 18 (8): 670-674.

    8. Adler HM. История настоящего заболевания как лечение: кто слушает и почему это важно? J Am Board Fam Pract . 1997; 10 (1): 28-35.

    9. Сучман А.Л., Маркакис К., Бекман Х.Б., Франкель Р.
      Модель эмпатического общения в медицинском интервью.

      ЯМА .1997; 277 (8): 678-682.

    10. Финк П., Соренсен Л., Энгберг М., Холм М., Мунк-Йоргенсен П.
      Соматизация в первичной медико-санитарной помощи. Распространенность, обращение за медицинской помощью и признание врачей общей практики.

      Психосоматика .

      1999; 40 (4): 330-338.

    11. Беллет PS, Мэлони MJ.
      Важность сочувствия как навыка собеседования. ЯМА .

      1991; 266 (13): 1831-1832.

    12. Анфосси М., Нумико Г.
      Сочувствие в отношениях между врачом и пациентом.

      Дж. Клин Онкол .

      2004; 22 (11): 2258-2259.

    13. Тайгман М. Можно ли научить сочувствию и состраданию? JEMS. 1996; 21 (6): 42-43, 45-46, 48.

    14. ДасГупта С., Харон Р.Рассказы о личных болезнях: использование рефлексивного письма для обучения сочувствию.

      Акад. Мед. .

      2004; 79 (4): 351-356.

    15. Платт Ф.В., Келлер В.Ф.
      Эмпатическое общение: навык, которому можно научить и чему научиться.

      Дж. Стажер Мед. .

      1994; 9 (4): 222-226.

    Цитата

    Виртуальный наставник. 2007; 9 (6): 423-427.

    DOI

    10.1001 / virtualmentor.2007.9.6.medu1-0706.

    Благодарности

    Я хотел бы поблагодарить докторов наук. Патрику Латторе и Питеру Кацуфракису за их советы по всем аспектам этого проекта, а также гранту на проведение летних исследований Университета Южной Калифорнии за финансовую поддержку.


    Точки зрения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды и политику AMA.

    Информация об авторе

    • Эллиот М. Хирш, доктор медицины , недавно окончил Медицинскую школу Кека Университета Южной Калифорнии. В июле он начнет семилетнюю резиденцию по комплексной пластической и реконструктивной хирургии в Медицинском центре Макгоу Северо-Западного университета в Чикаго.

    сцеживание молока | Северо-западная медицина

    А
    B
    C
    D
    E
    F
    грамм
    ЧАС
    я
    J
    K
    L
    M
    N
    О
    п
    Q
    р
    S
    Т
    U
    V
    W
    Икс
    Y
    Z

    Щелкните букву, чтобы просмотреть список условий, начинающихся с этой буквы.

    Щелкните «Указатель тем», чтобы вернуться к указателю текущей темы.

    Щелкните «Указатель библиотеки», чтобы вернуться к списку всех тем.

    Работа, учеба или даже вечерний просмотр кино могут потребовать, чтобы вы были далеко от вашего ребенка. Это не значит, что вы должны отказаться от грудного вскармливания. Кормление ребенка грудью идеально. Если вам необходимо находиться вдали от ребенка, вы можете сцеживать молоко из груди. Обсудите со своим врачом, как лучше всего кормить ребенка сцеженным грудным молоком.Но помните, что не давайте ребенку бутылочки или пустышки до тех пор, пока ему не исполнится 4-6 недель, если только этого не потребуют по состоянию здоровья. Это поможет вам обоим хорошо начать грудное вскармливание. Ваш ребенок сначала может привыкнуть к естественному соску.

    Всегда мойте руки перед сцеживанием молока из груди.

    Стимулирующее расслабление

    • Подержите тряпку под очень теплой водой и отожмите.

    • Оберните каждую грудь по одной теплой мочалке, чтобы согреть их.

    • Слегка помассируйте грудь, чтобы стимулировать выделение молока.

    • Начните под мышкой и двигайтесь по всей груди.

    • С помощью тыльной стороны ногтей аккуратно поцарапайте кожу груди по направлению вниз от внешней стороны к соскам.

    • Если вы находитесь далеко от малыша, посмотрите на его фотографию, чтобы у вас уменьшилось количество молока.

    Сдавливание вручную или насосом

    Ваш консультант по грудному вскармливанию может помочь вам выбрать лучший метод для ваших нужд. Вот несколько советов:

    • Сжимание вручную снижает давление в опухших или протекающих грудях. Это может быть хорошим способом начать сеанс сцеживания. Если вам нужно дать ребенку сцеженное молоко в первые несколько дней после родов, сцеживание руками часто помогает получить больше молозива, чем при использовании помпы.Попросите медсестру или акушерку научить вас сцеживать молоко вручную.

    • Начните сцеживать в течение 6 часов после разлуки с ребенком в больнице.

    • Когда ребенок разлучен с ребенком, лучше всего сцеживать его так часто и до тех пор, пока ребенок кормит грудью. Новорожденные кормятся от 8 до 12 раз каждые 24 часа.

    • Помпа мягко втягивает сосок в чашку, как сосание ребенка, и может быть самым быстрым способом сцеживания после того, как поступило молоко.Насосы бывают ручными, с батарейным питанием и электрическими. Чтобы защитить свою грудь и молоко, которое вы сцеживаете, следуйте инструкциям, прилагаемым к помпе.

    • Для больных или недоношенных детей, которые не кормят грудью, «сцеживание руками» — это особый способ убедиться, что у вас вырабатывается достаточно молока. Практическое сцеживание включает в себя сочетание движения руками и электрического насоса.

    • Сцеживание вручную при использовании насоса может увеличить количество молока, которое вы можете сцеживать.Это также может повысить жирность откачиваемого молока.

    • Обычно помпу можно купить или арендовать в аптеке или магазине медицинского оборудования. Обратитесь в свою больницу, чтобы узнать, где можно купить или арендовать помпу.

      Выражение руками
      Сдавливание двойным насосом

    Работа и кормление грудью

    • Кормите ребенка грудью все время во время отпуска по беременности и родам.Это помогает настроить количество молока на весь год.

    • Когда вашему ребенку исполнится около 2 недель, начните сцеживать молоко после того, как покормите его. Вы можете заморозить это сцеженное молоко. Это поможет вам создать запас для того, чтобы вернуться к работе. Кормление плюс сцеживание поможет вашей груди вырабатывать больше молока. Кормление ребенка грудью идеально. Если вам необходимо находиться вдали от ребенка, вы можете сцеживать молоко из груди. Обсудите со своим врачом, как лучше всего кормить ребенка сцеженным грудным молоком.

    • Сгущенное молоко в перерывах между работой. Это помогает сохранить количество молока. Это также помогает предотвратить набухание или подтекание груди.

    • Устройте кормление грудью во время обеда, если ваш ребенок находится поблизости. Если нет, обязательно сделайте сцеживание во время обеденного перерыва.

    • Кормите грудью перед уходом на работу и вскоре после возвращения домой. Ваш партнер может приготовить ужин, пока вы кормите ребенка.

    • Кормление грудью ночью и по выходным. Это будет поддерживать количество молока. Поговорите со своим врачом о лучших способах кормления ребенка сцеженным грудным молоком.

    Медицинский онлайн-обозреватель:
    Донна Фриборн PhD CNM FNP

    Медицинский онлайн-обозреватель:
    Хизер Тревино

    Медицинский онлайн-обозреватель:
    Мэри Террелл, доктор медицины

    Дата последней редакции:
    01.06.2020

    © 2000-2021 Компания StayWell, LLC.Все права защищены. Эта информация не предназначена для замены профессиональной медицинской помощи. Всегда следуйте инструкциям лечащего врача.

    Разница между явным и подразумеваемым согласием

    Прямое согласие дается четко и прямо, посредством письменного разрешения или устного соглашения. Практикующим врачам требуется разрешение пациента на многие виды медицинских процедур, особенно когда речь идет о инвазивных процедурах, таких как хирургия.Как пациент, вы имеете право понимать риски, связанные с вашим лечением, принимать решения за себя и защищать свою физическую неприкосновенность. Если не возникнет чрезвычайной ситуации, вы можете согласиться на любое лечение или отказаться от него. Вот сложная часть: ваше согласие может быть в разных формах, и в контексте заявления о злоупотреблении служебным положением иногда бывает сложно установить, действительно ли вы дали согласие на процедуру. Чтобы полностью понять эту дилемму, важно различать явное и подразумеваемое согласие.Обратитесь к опытному юристу за бесплатной консультацией по вашему конкретному делу.

    Как путают согласие?

    Может показаться невероятным думать, что врач выполнит процедуру без согласия пациента, но ошибка может быть сделана в нескольких различных сценариях. В некоторых случаях ошибка более очевидна, например, когда пациент соглашается только на косметическую операцию на носу, но врач выполняет операцию и на губах. Этот пациент явно не давал разрешения на дополнительную процедуру, что привело к нежелательным физическим изменениям.В других случаях поставщик медицинских услуг может не дать пациенту информативного объяснения процедуры перед запросом согласия — или он может полностью неправильно понять согласие.

    Чтобы получить бесплатную юридическую консультацию, позвоните по телефону 516-358-6900

    Как вы даете явное согласие?

    Как пациент, вы даете явное согласие, когда вы даете свое разрешение ясно и прямо. Подписывая медицинские отказы или аналогичные документы, вы даете прямое согласие на конкретное лечение.Вы также можете выразить свое согласие, сделав четкое устное заявление, например: «Да, я согласен на эту процедуру». Письменное разрешение обычно требуется для сложных или рискованных процедур, обследований, которые в первую очередь не предназначены для оказания клинической помощи, процедур, которые могут иметь социальные или личные последствия для пациента, и лечения, проводимого в рамках исследовательской программы.

    Как врач получает подразумеваемое согласие?

    В отличие от явного согласия, подразумеваемое согласие часто передается через ваши действия.Таким образом, в юридическом контексте доказать сложнее. Вы можете дать подразумеваемое согласие, кивнув головой, засучив рукав, позволяя медсестре взять образец крови, или постившись в течение 24 часов перед запланированной операцией. Подразумеваемое согласие также может иметь место в середине операции, то есть, если хирург выполняет дополнительную процедуру, чтобы убедиться, что операция прошла успешно. Также возможно подписать отказ, дающий разрешение на выполнение любых других необходимых процедур, о которых, возможно, не было известно заранее.

    Нажмите, чтобы связаться с нашими юристами по травмам сегодня

    Насколько важно быть проинформированным?

    Письменное прямое согласие может показаться надежной защитой от исков о злоупотреблении служебным положением, но для того, чтобы его отклонить в суде, требуется еще один важный фактор: информация. Пациент должен полностью понимать характер и цель любого медицинского обследования или процедуры, включая риски, преимущества и возможные побочные эффекты. Без обширной и точной информации вы не можете дать осознанное согласие.Вы можете получить письменную информацию или буклеты, но ваш врач должен найти время, чтобы обсудить процедуру и ответить на ваши вопросы.

    Помимо серьезных чрезвычайных ситуаций, когда невозможно получить ваше согласие или ваше состояние опасно для жизни, медицинские работники также должны иметь ваше письменное согласие на многие виды обследований и процедур. Если вы подписали медицинский отказ, не зная всех фактов, и в результате вам был причинен вред, у вас может быть основание для судебного иска о врачебной халатности.

    Заполните бесплатную форму оценки дела прямо сейчас

    Свяжитесь с адвокатом Лонг-Айленда по вопросам медицинской халатности сегодня

    Позвоните в адвокатское бюро Cohen & Jaffe, LLP, чтобы обсудить вашу ситуацию со знающим адвокатом. Мы стремимся защищать ваши права как пациента и привлекать к ответственности практикующих врачей. Запишитесь на бесплатную консультацию онлайн или позвоните нам по телефону 516-358-6900.

    Позвоните или отправьте текстовое сообщение 516-358-6900 или заполните форму бесплатной оценки случая

    Видеоинструкция по сцеживанию грудного молока вручную от Stanford Medicine

    Это очень полезный обучающий видеоролик по сцеживанию грудного молока вручную, представленный Stanford Medicine.Ручное сцеживание можно использовать для подтверждения наличия молозива перед первым сеансом кормления грудью и на каждом последующем сеансе. Это можно делать во время кормления грудью, чтобы помочь мамам опорожнять грудь от молозива / молока и помочь новорожденным, у которых могут быть проблемы с захватом, легче получать молоко. Это может помочь матерям не только обеспечить, чтобы их дети были сыты, но также может помочь стимулировать выработку грудного молока в том случае, если сеансы кормления грудью прерываются медицинским вмешательством, необходимым ребенку или маме.

    У нас есть разные рекомендации по адекватным объемам кормления, которые в первую очередь зависят от уровня удовлетворенности новорожденных грудным вскармливанием, но это очень полезное обучающее видео по этому очень важному навыку.

    https://med.stanford.edu/newborns/professional-education/breastfeeding/hand-expressing-milk.html


    Мы считаем, что все младенцы заслуживают защиты от голода и жажды каждый божий день их жизни. и мы считаем, что обучение безопасному вскармливанию младенцев должно быть бесплатным.Если вы хотите сделать пожертвование в поддержку миссии фонда Fed is Best Foundation по обучению каждого родителя безопасному вскармливанию грудного ребенка, рассмотрите возможность внесения разового или периодического пожертвования в нашу организацию.

    Пожертвовать Fed is Best

    Заявление об ограничении ответственности: этот документ не заменяет личную оценку и лечение у врача. Этот документ предназначен для информирования родителей о самых последних данных о вскармливании младенцев и повышения их знаний о том, как защитить своих новорожденных от гипербилирубинемии, обезвоживания, гипернатриемии, гипогликемии, а также длительных или повторных госпитализаций из-за осложнений, вызванных недоеданием.Раннее добавление может потребоваться для недоношенных детей или детей с заболеваниями. Родителям рекомендуется обратиться за консультацией к педиатру по любым вопросам, связанным со здоровьем и безопасностью ребенка, если они возникнут.

    Как это:

    Нравится Загрузка …

    Walk-In Clinic Near Me в Сент-Чарльзе, штат Иллинойс,

    Physician Express — это центр неотложной помощи, который удобно расположен недалеко от 64 и N Randall Road в 2000 W. Main St. Suite M St.Чарльз, Иллинойс. Наши услуги включают неотложную медицинскую помощь, неотложную медицинскую помощь, медицинскую помощь без врача, профессиональную гигиену и первичную медицинскую помощь.

    Мы предлагаем разнообразные услуги, которые доступны каждый день в году.

    Мы здесь, чтобы предложить вам исключительное медицинское обслуживание в удобное для вас время.

    Мы предлагаем часы работы вне обычного рабочего времени кабинета вашего врача. Мы открыты все выходные и праздничные дни.

    Наши сотрудники заботятся о вашем здоровье.

    В нашем офисе можно быстро пройти медосмотр, чтобы сэкономить ваше время и в конечном итоге достичь своей цели быстрее, чем ждать открытия в обычном графике вашего врача.Вы лихорадочно искали вакцинацию перед поездкой с семьей за пределы США? Наши поставщики услуг обладают опытом и знаниями, чтобы подобрать вам подходящие лекарства и иммунизацию в соответствии с вашими конкретными потребностями. Ваш ребенок упал и получил перелом кости, порез или мышечную травму? Наши сотрудники имеют опыт работы с семейной медициной и могут быть отличным помощником для своего постоянного врача, когда вам это нужно больше всего. Возможно, пришло время их ежегодной спортивной физкультуры, чтобы ваш подросток мог быть допущен к школьным и очным спортивным командам.

    Доктор Пател из Physician Express — сертифицированный врач семейной медицины, который с радостью осмотрит вашего ребенка на медицинский осмотр и при любых травмах, связанных со спортом. Будьте уверены, у вас будет более короткое время ожидания, обычно в течение часа, чем вы обычно сталкиваетесь в местном отделении неотложной помощи. Стандарт медицинского обслуживания, который мы практикуем в отделении неотложной помощи в Сент-Чарльзе, гарантированно оправдает ваши ожидания. Этот центр неотложной медицинской помощи открыт 365 дней в году, и мы предлагаем часы работы вне обычных часов работы вашего обычного кабинета врача.Наши сотрудники заботятся о вашем здоровье, и если вы нам не верите, просмотрите наши отзывы, чтобы узнать, что другие говорят о нашей клинике неотложной помощи. Прекратите искать ближайшего врача; посетите наш центр неотложной помощи в Сент-Чарльзе, штат Иллинойс, чтобы узнать, что мы можем для вас сделать.

    Если вы страдаете от чего-то опасного для жизни, наберите 911 или немедленно обратитесь в ближайшее отделение неотложной помощи.

    Благодарность может сделать вас счастливее

    Ноябрь открывает курортный сезон с больших ожиданий уютного и праздничного времени года.Однако для многих это время года окрашено в печаль, тревогу или депрессию. Несомненно, при большой депрессии или тяжелом тревожном расстройстве больше всего помогает профессиональная помощь. Но что делать тем, кто чувствует себя потерянным, подавленным или подавленным в это время года? Исследования (и здравый смысл) показывают, что один аспект сезона Благодарения может действительно поднять настроение, и он встроен прямо в праздник — выражение благодарности.

    Слово благодарность происходит от латинского слова gratia , что означает благодать, милосердие или благодарность (в зависимости от контекста).В некотором смысле благодарность охватывает все эти значения. Благодарность — это благодарная признательность за то, что человек получает, материальное или нематериальное. С благодарностью люди признают добро в своей жизни. В процессе люди обычно осознают, что источник этого добра лежит, по крайней мере, частично, вне их самих. В результате благодарность также помогает людям соединиться с чем-то большим, чем они сами как личности — будь то другие люди, природа или высшая сила.

    В исследованиях позитивной психологии благодарность прочно и неизменно ассоциируется с большим счастьем.Благодарность помогает людям испытывать больше положительных эмоций, получать удовольствие от хороших впечатлений, улучшать свое здоровье, справляться с невзгодами и строить прочные отношения.

    Люди чувствуют и выражают благодарность разными способами. Они могут применять его к прошлому (получение положительных воспоминаний и благодарность за элементы детства или прошлых благословений), настоящему (не принимая удачу как должное) и будущему (поддерживая обнадеживающий и оптимистичный настрой). Независимо от присущего или нынешнего уровня чьей-либо благодарности, это качество, которое люди могут успешно развивать в дальнейшем.

    Исследование благодарности

    Два психолога, доктор Роберт А. Эммонс из Калифорнийского университета в Дэвисе и доктор Майкл Э. Маккалоу из Университета Майами, провели большую часть исследований благодарности. В одном исследовании они попросили всех участников писать несколько предложений каждую неделю, уделяя особое внимание определенным темам.

    Одна группа писала о вещах, за которые они были благодарны, что произошло в течение недели. Вторая группа писала о ежедневных раздражениях или вещах, которые их не устраивали, а третья писала о событиях, которые их повлияли (без акцента на их положительном или отрицательном характере).Через 10 недель те, кто писал о благодарности, были более оптимистичны и чувствовали себя лучше в своей жизни. Удивительно, но они также больше тренировались и реже посещали врачей, чем те, кто сосредоточился на источниках обострения.

    Другой ведущий исследователь в этой области, доктор Мартин Э. П. Селигман, психолог из Пенсильванского университета, протестировал влияние различных позитивных психологических вмешательств на 411 человек, каждый из которых сравнил с контрольным заданием написать о ранних воспоминаниях.Когда их недельная задача заключалась в том, чтобы написать и лично доставить благодарственное письмо кому-то, кого никогда должным образом не благодарили за его или ее доброту, участники сразу же продемонстрировали огромный рост показателей счастья. Это влияние было сильнее, чем от любого другого вмешательства, и преимущества продолжались в течение месяца.

    Конечно, исследования, подобные этому, не могут доказать причинно-следственную связь. Но большинство исследований, опубликованных по этой теме, подтверждают связь между благодарностью и благополучием человека.

    Другие исследования изучали, как благодарность может улучшить отношения. Например, исследование пар показало, что люди, которые нашли время, чтобы выразить благодарность своему партнеру, не только чувствовали себя более позитивно по отношению к другому человеку, но и чувствовали себя более комфортно, выражая озабоченность своими отношениями.

    Менеджеры, которые не забывают сказать «спасибо» людям, которые работают на них, могут обнаружить, что эти сотрудники чувствуют мотивацию работать усерднее. Исследователи из школы Wharton при Пенсильванском университете случайным образом разделили сборщиков университетских средств на две группы.Одна группа звонила по телефону, чтобы собрать пожертвования от выпускников, как и всегда. Вторая группа, назначенная на работу в другой день, получила воодушевляющую речь от директора по ежегодным пожертвованиям, который сказал сборщикам средств, что она благодарна за их усилия. В течение следующей недели сотрудники университета, услышавшие ее послание с благодарностью, сделали на 50% больше звонков по сбору средств, чем те, кто этого не сделал.

    Есть несколько заметных исключений из в целом положительных результатов в исследованиях благодарности.Одно исследование показало, что разведенные женщины среднего возраста, которые вели дневники благодарности, были довольны своей жизнью не больше, чем те, кто этого не делал. Другое исследование показало, что дети и подростки, которые написали и доставили благодарственное письмо кому-то, кто изменил их жизнь, возможно, сделали другого человека счастливее, но не улучшили собственное благополучие. Этот вывод предполагает, что благодарность — это достижение, связанное с эмоциональной зрелостью.

    Способы воспитания благодарности

    Благодарность — это способ для людей ценить то, что у них есть, вместо того, чтобы всегда тянуться к чему-то новому в надежде, что это сделает их счастливее, или думать, что они не могут чувствовать себя удовлетворенными, пока не будут удовлетворены все физические и материальные потребности.Благодарность помогает людям сосредоточиться на том, что у них есть, а не на том, чего им не хватает. И хотя поначалу это может показаться надуманным, это психическое состояние усиливается по мере использования и практики.

    Вот несколько способов регулярно развивать благодарность.

    Напишите благодарственное письмо. Вы можете сделать себя счастливее и укрепить отношения с другим человеком, написав благодарственное письмо, в котором выразите свое удовольствие и признательность за то, что этот человек повлиял на вашу жизнь.Отправьте его, а еще лучше — доставьте и прочитайте лично, если это возможно. Возьмите за привычку отправлять хотя бы одно благодарственное письмо в месяц. Время от времени напишите что-нибудь себе.

    Поблагодарите кого-нибудь мысленно. Нет времени писать? Может помочь просто подумать о ком-то, кто сделал для вас что-то хорошее, и мысленно поблагодарить этого человека.

    Ведите дневник благодарности. Возьмите за привычку записывать или делиться с близким мыслями о подарках, которые вы получаете каждый день.

    Считайте свои благословения. Каждую неделю выбирайте время, чтобы сесть и написать о своих благословениях, размышляя о том, что прошло хорошо или за что вы благодарны. Иногда помогает выбрать число — например, от трех до пяти вещей, — которые вы будете определять каждую неделю. Когда вы пишете, будьте конкретны и подумайте об ощущениях, которые вы испытали, когда с вами случилось что-то хорошее.

    Молитесь. Религиозные люди могут использовать молитву для развития благодарности.

    Медитируйте. Медитация осознанности включает в себя сосредоточение на настоящем моменте без осуждения. Хотя люди часто сосредотачиваются на слове или фразе (например, «мир»), также можно сосредоточиться на том, за что вы благодарны (тепло солнца, приятный звук и т. Д.).

    Поделиться страницей:

    Заявление об ограничении ответственности:
    В качестве услуги для наших читателей Harvard Health Publishing предоставляет доступ к нашей библиотеке заархивированного содержимого.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *